[发明专利]一种淡水鱼类筛选微卫星序列的方法

权利要求书

1.一种淡水鱼类筛选微卫星序列的方法，其步骤包括：

（1）鱼类肌肉DNA的提取；

（2）用MboⅠ酶切基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳，切下300-800bpDNA片段的凝胶，回收；

（3）酶切片段与Sau LA /Sau LB 接头连接，接头序列为：

Oligo A：5＇-GGCCACAGACCCCACGCATCG-3＇ (SEQ ID NO.1)

和

Oligo B：5＇-PO4- GATACGAAGCTTGGGCTCTCTCG CC- 3＇(SEQ ID NO.2)；

（4）采用磁珠，选择AGC、ACAG、ATCT重复序列的探针进行富集微卫星序列，获得富含SSR重复的单核苷酸序列；

（5）以Sau3AL为引物，PCR扩增含有微卫星序列的DNA片段；

（6）将PCR扩增的纯化产物与pGEM-TEasy载体(Promega)连接，克隆转化；

（7）含有微卫星序列阳性克隆的PCR法筛选，菌落PCR产物能给出两条或者以上的条带，说明这个单克隆含有目的序列，反之则没有；

（8）序列分析，利用DNA star软件编辑序列，先去除载体序列得的基因组序列，利用SSRhunte找出含有微卫星的序列。

2.根据权利要求1所述的一种淡水鱼类筛选微卫星序列的方法，其特征在于，步骤（5）所述PCR反应条件为：95℃预变性3分钟，接着5个循环包括95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，然后进行另外30个循环的92℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸55s，最后于72℃下延伸30分钟。

3.根据权利要求1所述的一种淡水鱼类筛选微卫星序列的方法，其特征在于，步骤（6）所述克隆转化过程中，需挑选白色菌落，于200μl Amp+ LB液体培养基中，37℃摇床4-7小时，扩大培养。

4.根据权利要求1所述的一种淡水鱼类筛选微卫星序列的方法，其特征在于，步骤（7）所述的微卫星序列阳性克隆的PCR，其反应条件为：96℃预变性5分钟，96℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，最后于72℃下延伸10分钟。