[发明专利]一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测硫嘌呤(巯嘌呤，硫鸟嘌呤和硫唑嘌呤)不良反应风险SNP位点的试剂盒及其方法。

背景技术

硫嘌呤(巯嘌呤，硫鸟嘌呤和硫唑嘌呤)是癌症、器官移植、自身免疫疾病(如多发性硬化症、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、原发性胆汁硬化症、炎症性肠炎)中最重要和广泛应用的药物之一。骨髓抑制是硫嘌呤最常见的不良反应，包括白细胞减少，巨幼细胞性贫血，血小板减少，全血细胞减少，严重者可危及生命。

大多数研究人员推测，硫嘌呤引起的细胞毒性是由6-硫鸟嘌呤核苷酸(6-TGN)浓度引起的DNA损伤引起的，6-TGN浓度高的患者变化主要由硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)活性的变化所引起，有研究表明，与对照组相比，骨髓抑制患者TPMT活性非常低，6-TGN异常高。可变的TPMT活性导致6-TGN和6-甲基巯基嘌呤核糖核苷酸代谢产物的差异产生，TPMT活性降低使代谢途径转向6-TGN的生产。亚洲人群中主要的TPMT变体为*3C，等位基因频率为2.3％。TPMT基因野生纯合型*1*1(AA)TPMT活性正常；突变杂合型*1*3C(AG)TPMT活性中度下降；突变纯合型*3C*3C(GG)，TPMT活性缺失。

硫嘌呤诱导的白细胞减少在亚洲人群中很常见，核苷二磷酸连接部分X型基序15(NUDT15)是可将8-氧代-dGTP和8-氧代-dGDP转化为8-氧代-dGMP的含有164氨基酸的蛋白质，从而除去来自细胞的氧化损伤的鸟嘌呤核苷酸，使DNA损伤最小化。体外和体内研究表明，NUDT15可以负调节硫嘌呤激活，避免导致细胞毒性。目前的荟萃分析表明，NUDT15c.415C>T等位基因与给予硫嘌呤的患者发生白细胞减少的风险增加密切相关。与无基因患者相比，NUDT15c.415C>T的硫嘌呤使用者的白细胞减少风险显着增加了3.79倍。NUDT15c.415C>T变体在亚洲和西班牙裔中最常见，在欧洲和非洲人中罕见，东亚国家NUDT15变种的流行率越高，可能会导致这个人群中硫代嘌呤不耐受的过度表现。

肌苷三磷酸焦磷酸酶(ITPA)催化6-TIMP的无效循环，以避免6-硫基次黄嘌呤三磷酸盐(6-thioinosine triphosphate，6-TITP)的积累。在硫嘌呤治疗下，ITPA活性低的患者比ITPA活性高的患者更容易出现不良反应。而ITPA也由遗传决定的，ITPA 94C>A(Pro32Thr，rs1127354)变体纯合的患者的ITPA酶活性低下或缺失，94C>A变体的催化活性降低可能是由于对核苷酸的亲和力受到干扰而引起的。

因此，提供一种能同时检测硫嘌呤(巯嘌呤，硫鸟嘌呤和硫唑嘌呤)不良反应风险密切相关的TPMT*3、ITPA、NUDT15、TPMT*2基因的单核苷酸多态性位点(SNP)基因型，以此来评估硫嘌呤在自身免疫性疾病及其他疾病使用中的不良反应风险，很有必要。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒针对人类基因组DNA中硫嘌呤药物不良反应风险的3个SNP位点，即TPMT*3(T>C)rs1142345，ITPA(94C>A)rs1127354，NUDT15rs116855232，设计特异性引物和野生型/突变型探针，与偶联相应报告探针的MagPlex-TAG磁珠进行杂交反应，通过显色反应在luminex 200仪器上进行检测，通过对信号值的读取判读各个SNP位点的碱基型别进行判定。

一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的试剂盒，所述的试剂盒包括有如下序列的特异引物：

涉及的特异探针序列如下：

涉及的报告探针序列如下：

一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的方法，所述的方法包括如下的步骤：首先进行PCR反应，实现扩增；再进行多重OLA反应，标记和连接；然后进行杂交反应，最后进行基因型的分析。

PCR反应体系如下：2x qiagen Hotstar MM 5ul,primer mix 1ul，DNA样本2ul,灭菌水2ul。

PCR反应条件为95℃、15min，进行30个循环的94℃,30秒，60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。

多重OLA反应如下：配制2xOLA master mix，将OLA master mix与PCR反应产物混合，混匀后进行连接反应。