[发明专利]一种利用大肠杆菌生产肠杆菌肽的工艺及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种利用大肠杆菌生产肠杆菌肽的工艺及其应用。

背景技术

乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉、玉米淀粉、玉米浆干粉、玉米浆等是常用的发酵工业用碳源。牛骨蛋白胨、鱼蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白胨、水解乳蛋白、酵母膏、酵母浸粉、酵母粉、牛肉膏、牛肉浸粉、大豆粕粉、大豆饼粉等是常用的发酵工业用氮源。碳源、氮源、无机盐和微量元素、生长因子是组成基础发酵生产培养基的成分。通过在基础发酵生产培养基中补充碳源、氮源，进行补料分批高密度发酵工艺优化，可以显著提高生物发酵效价，降低发酵原料成本，缩短发酵生产周期，具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点。

近年来随着抗生素的大量使用，细菌耐药性不断形成，致使现有抗菌药物对细菌感染治疗的疗效低下或无效，形成的危害日益严重。如何克服细菌的耐药性是当前的研究重点和热点，科研工作者们正努力寻求新的抗菌策略，这迫切需要开发出新型的抗菌制剂。高效、低毒、不易形成耐药性的抗菌肽作为最有希望代替抗生素的新药制剂倍受国内外科研工作者的关注。

目前国内外对于肠杆菌肽的研究，除了申请人(中农颖泰集团)进入量产阶段外，大部分还是部分科学院校处于实验室初步研究阶段，有关其报道和文献几乎没有。申请人的技术团队经过几年专心研究，已经成功的从实验室研究阶段进入到了大批量生产阶段，肠杆菌肽的发酵生产、分离纯化技术目前在国内外处于领先水平。肠杆菌肽在临床上主要治疗畜禽由于大肠杆菌、沙门氏菌等引起的腹泻，随着肠杆菌肽的工业化生产的实现，逐步会减少、替代抗生素在治疗畜禽腹泻方面的应用。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的不足之处，提供一种利用大肠杆菌生产肠杆菌肽的工艺及其应用。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一株大肠杆菌ZNYT2，所述大肠杆菌ZNYT2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年8月23日，保藏编号为：CGMCC No.12902，分类命名：大肠埃希氏菌。

一种利用如上述的大肠杆菌ZNYT2生产肠杆菌肽的工艺，包括以下步骤：

(1)菌种的分离：通过对户外采集样本的富集以及初筛、复筛，从初筛菌株中筛选出产生的抑菌物质能够很好的耐受高温和蛋白酶处理，而且菌株生长迅速，抑菌圈大且明显的菌株S49-2，命名为益生大肠杆菌ZNYT2；

(2)菌种的诱变：将分离得到的益生大肠杆菌ZNYT2原始菌株扩大培养后，配制成菌悬液后，先利用氦氖激光对菌悬液中的菌株进行诱变，经过培养和筛选，挑出生长快速、透明圈直径大的菌株，再利用紫外亚硝基胍进行复合诱变，经过培养和初筛，挑出生长快速、透明圈直径大的菌株，进行复筛，获得稳定高产菌株；

(3)菌种的扩大培养

将步骤(2)中得到的稳定高产大肠杆菌ZNYT2进行菌种活化、摇瓶培养和种子罐培养，获得种子发酵液；

(4)发酵罐中发酵培养

将步骤(3)中得到的种子发酵液接种于发酵罐中的发酵罐培养基上，进行发酵培养获得发酵液；

(5)对步骤(4)中得到的发酵液进行后处理，获得肠杆菌肽

a.双效浓缩；利用双效分离器在真空条件下进行浓缩；

b.醇沉：将双效浓缩后的发酵液的含醇量调至体积分数为65％-85％，于4℃下进行醇沉；

c.离心：将醇沉后的发酵液进行离心分离，收集上清液；

d.脱色：将离心后的上清液经过氧化铝渗漉柱进行脱色；

e.醇回收：回收经过脱色后的发酵液中的乙醇至无醇味；

f.盐析：向经过醇回收后的发酵液中加入硫酸铵，变加边搅拌，加完硫酸铵后继续搅拌1-2h，静置12-15h，离心，收集沉淀，多肽的盐析分离采用饱和硫酸铵溶液法；根据硫酸铵饱和度溶液表可知，1L发酵液加入767g硫酸铵固体；

g.微滤：将收集到盐析沉淀进行复溶，溶剂为体积分数为20％的乙醇溶液，再将复溶后的溶液通过0.45μm微滤滤膜进行微滤，收集微滤液；

h.柱层析分离：利用层析柱对微滤液进行柱层析分离，采用梯度洗脱法，收集洗脱液；

i.超滤：将柱层析的洗脱液通过1000Da超滤膜进行超滤，收集截留液；

j.冻干：对超滤后的截留液进行低温真空冷冻干燥，即得肠杆菌肽纯品。

所述步骤(5)中的h步骤中所用层析柱为BPG200/500层析柱。