[发明专利]一种利用大肠杆菌生产肠杆菌肽的工艺及其应用

权利要求书

1.一株大肠杆菌ZNYT2，其特征在于：所述大肠杆菌ZNYT2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年8月23日，保藏编号为：CGMCC No. 12902，分类命名：大肠埃希氏菌。

2.一种利用如权利要求1所述的大肠杆菌ZNYT2生产肠杆菌肽的工艺，其特征在于，包括以下步骤：

（1）菌种的分离：通过对户外采集样本的富集以及初筛、复筛，从初筛菌株中筛选出产生的抑菌物质能够很好的耐受高温和蛋白酶处理，而且菌株生长迅速，抑菌圈大且明显的菌株S49-2，命名为益生大肠杆菌ZNYT2；

（2）菌种的诱变：将分离得到的益生大肠杆菌ZNYT2原始菌株扩大培养后，配制成菌悬液后，先利用氦氖激光对菌悬液中的菌株进行诱变，经过培养和筛选，挑出生长快速、透明圈直径大的菌株，再利用紫外亚硝基胍进行复合诱变，经过培养和初筛，挑出生长快速、透明圈直径大的菌株，进行复筛，获得稳定高产菌株；

（3）菌种的扩大培养

将步骤（2）中得到的稳定高产大肠杆菌ZNYT2进行菌种活化、摇瓶培养和种子罐培养，获得种子发酵液；

（4）发酵罐中发酵培养

将步骤（3）中得到的种子发酵液接种于发酵罐中的发酵罐培养基上，进行发酵培养获得发酵液；

（5）对步骤（4）中得到的发酵液进行后处理，获得肠杆菌肽

a. 双效浓缩；利用双效分离器在真空条件下进行浓缩；

b. 醇沉：将双效浓缩后的发酵液的含醇量调至体积分数为65%-85%，于4℃下进行醇沉；

c. 离心：将醇沉后的发酵液进行离心分离，收集上清液；

d. 脱色：将离心后的上清液经过氧化铝渗漉柱进行脱色；

e. 醇回收：回收经过脱色后的发酵液中的乙醇至无醇味；

f. 盐析：向经过醇回收后的发酵液中加入硫酸铵，变加边搅拌，加完硫酸铵后继续搅拌1-2h，静置12-15h，离心，收集沉淀，多肽的盐析分离采用饱和硫酸铵溶液法；根据硫酸铵饱和度溶液表可知，1L发酵液加入767g硫酸铵固体；

g. 微滤：将收集到盐析沉淀进行复溶，溶剂为体积分数为20%的乙醇溶液，再将复溶后的溶液通过0.45μm微滤滤膜进行微滤，收集微滤液；

h. 柱层析分离：利用层析柱对微滤液进行柱层析分离，采用梯度洗脱法，收集洗脱液；

i. 超滤：将柱层析的洗脱液通过1000Da超滤膜进行超滤，收集截留液；

j. 冻干：对超滤后的截留液进行低温真空冷冻干燥，即得肠杆菌肽纯品。

3.根据权利要求2所述的生产肠杆菌肽的工艺，其特征在于：所述步骤（5）中的h步骤中所用层析柱为BPG200/500层析柱。

4.根据权利要求2所述的生产肠杆菌肽的工艺，其特征在于：所述步骤（5）中的h步骤中柱层析分离的具体步骤为：

（1）先用纯水冲洗柱子至基线平衡；Buffer A冲洗柱子2CV；

（2）加载样品，上样量为一倍的柱体积；

（3）Buffer A平衡柱子3CV；

（4）Buffer B 0-100%线性梯度洗脱，观察电导变化及谱图，收集目标物质峰；

（5）Buffer B 3CV冲洗柱子至基线及电导降到纯水电导为止，准备下一次上样；

缓冲液： BufferA：1M/L氯化钠；BufferB：纯水；

样品溶液的配制：肠杆菌肽用体积分数为20%乙醇溶液进行溶解，用药用级氯化钠调电导至55ms/cm。

5.根据权利要求2所述的工艺生产得到的肠杆菌肽。

6.根据权利要求2所述的工艺所制备的肠杆菌肽在饲料领域中的应用。