[发明专利]快速鉴定大豆疫霉β-tubulin基因核苷酸点突变及其对噻唑菌胺抗药性的方法

说明书

本发明涉及大豆疫霉微管蛋白基因β‑tubulin核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂噻唑菌胺抗性监测中的应用，公开了一种鉴定大豆疫霉β‑tubulin基因23位、772位和494位核苷酸突变对噻唑菌胺产生抗药性的分子检测方法及其专用引物。所述突变位点指大豆疫霉菌中β‑tubulin基因自5'末端起第23位、772位和494位核苷酸分别为纯合T、G和A以及β‑tubulin蛋白自N端起第8位、258位和165位氨基酸为纯合的亮氨酸、缬氨酸和酪氨酸。该检测方法，灵敏度高，稳定性好，可用于高通量地监测田间大豆疫霉对噻唑菌胺的抗性发生和发展情况，实现抗性病害的早期预警，指导合理用药，延缓抗药性的发生和发展。

技术领域

本发明涉及一种鉴定大豆疫霉微管蛋白β-tubulin基因核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂噻唑菌胺抗性检测中的应用，具体公开一种快速鉴定大豆疫霉β-tubulin基因核苷酸点突变及其对噻唑菌胺抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物学技术领域。

背景技术

大豆疫霉(Phytophthora sojae)是十大植物病原卵菌之一，有性生殖方式为同宗配合。其寄主范围单一，主要侵染大豆，引起大豆根腐病。该病是大豆生产上的重要病害之一，严重时导致绝产。该病于1948年在美国的印第安纳州首次发现，以后迅速扩展到加拿大、巴西、阿根廷及欧洲、非洲的一些国家，目前已遍布于世界各大豆主产区，每年造成数十亿美元的经济损失。

目前，化学防治以其速效和高效的特点，在大豆疫霉等植物病原卵菌病害的防治中依然发挥着不可替代的作用。但是随着一些内吸性杀菌剂的不合理频繁使用，许多植物病原卵菌已经对其产生了严重的抗药性。因此，国际上各大农化公司一直致力于开发具有新作用机制且与市场上现有杀菌剂无交互抗药性的新型杀菌剂，用于大豆疫霉等植物病原卵菌病害的防治和抗药性治理。

噻唑菌胺(ethaboxam)是韩国LG生命科学公司(原LG化学有限公司)开发的噻唑酰胺类杀菌剂，其商品名Guardian。1998年，噻唑菌胺首先在韩国获准登记为新颖杀菌剂。噻唑菌胺是一种内吸性的杀菌剂，具有保护和治疗活性，主要防治对象为植物病原卵菌。研究发现噻唑菌胺对病菌微管有一定的破坏作用，它能够影响微管的完整性，推测其为微管蛋白抑制剂。

目前，噻唑菌胺正在全球不同地区申请登记用于防治大豆疫霉菌，辣椒疫霉菌，黄瓜霜霉病菌及葡萄霜霉病菌等植物病原卵菌的防治，具有广阔的应用前景。但是，本研究室通过药剂驯化的方法得到了对噻唑菌胺分别产生低抗和高抗性水平的大豆疫霉菌株，并且抗性菌株具有一定的生存适合度，表明具有低到中等的抗性风险。因此，在使用噻唑菌胺防治植物病原卵菌病害时需要关注并避免抗药性的产生，加强检测和早期预警病原菌对噻唑菌胺的抗性发生发展情况，这有助于指导噻唑菌胺的科学使用，延缓抗药性的发生和发展，延长药剂的使用年限。

杀菌剂抗性常规检测方法包括：菌丝生长速率法、菌丝干重测定法、孢子萌发测定法和琼脂展布法等。但是这些方法都需要先分离并纯化病原菌，然后接种于带药培养基上或接种于杀菌剂处理过的活体植株或组织上，一定时间之后才能调查结果。采用常规的方法，当田间抗药性菌株的频率＞1％时，才能被检测到(如有95％的概率检测到1％频率的抗药性菌株，检测的样本量需大于300)，因此具有灵敏度低，工作量大，试验周期长等缺点。

随着分子生物学技术的飞速发展及其应用范围的不断扩展，等位特异PCR分子技术开始在病原菌抗药性检测中应用。与传统的检测方法比较，不但节省了检测时间、提高了工作效率，而且提高了检测的灵敏度，检测频率在10^-5～10^-4，更适用于检测低频率的抗药性基因，因此也被作为田间抗药性早期诊断的理想方法。因此，分子检测技术将在病害的可持续管理系统中发挥愈来愈重要的作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测大豆疫霉菌中β-tubulin基因是否存在突变位点的方法及其专用引物。