[发明专利]一种源于鮸鱼鱼鳔的降血脂五肽及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及寡肽领域，尤其是涉及一种源于鮸鱼鱼鳔的降血脂五肽及其应用。

技术背景

海鱼鱼鳔为“海洋八珍”之一，素有 “海洋人参”之誉。鱼鳔的主要营养成分为高级胶原蛋白等活性成分，其中蛋白质含量在80%以上，而脂肪含量较低。因此，鱼鳔是理想的高蛋白低脂肪食品。

我国食用鱼鳔有悠久的历史，北魏《齐民要术》、唐代《新唐书•地理志》和李时珍--《本草纲目》等对鱼鳔的性能均有记载。舟山当地，居民会给发育阶段小孩使用鮸鱼鱼鳔的干制品—鱼鳔胶，以提高小孩免疫力，促进发育。目前国内对鱼鳔的研究和利用仅限于鱼鳔的简单加工处理，对于海鱼鳔的研究主要集中在鳗鱼、立鱼和大黄鱼等。国外以鱼鳔为原料的研究亦鲜有报道，鱼鳔的基础研究明显不足。另一方面，现有研究报道的大多数海洋来源的降血脂物质集中在多糖、虾青素和不饱和脂肪酸等方面，仅有较少的海洋活性肽如紫菜多肽等报导有降血脂活性。因此，海洋生物多肽在降血脂方面的研究还有待加强。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种源于鮸鱼鱼鳔的降血脂五肽，降血脂五肽既能下调成脂基因，又能促进脂肪酸β氧化，具有良好的降脂活性。

本发明的目的之二在于提供一种源于鮸鱼鱼鳔的降血脂五肽的应用，降血脂五肽可作为降血脂活性成分、保健产品和食品添加剂。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种源于鮸鱼鱼鳔的降血脂五肽，本降血脂五肽的氨基酸序列为：Gly-Ile-Glu-Trp-Ala(GIEWA)，ESI-MS测定分子量为574.64Da；降血脂五肽能减少油酸（OA）诱导的HepG2细胞内脂质堆积，对总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）呈剂量依赖性分解作用，能下调成脂基因SREBP-1c、ACC、SREBP-2、HMGR和FAS的表达水平，抑制成脂重要因子SREBP-1c的蛋白表达水平，激活LXRα和LXRβ的表达。

作为优选，一种源于鮸鱼鱼鳔的降血脂五肽，其制备方法包括：预处理、酶解、提取，具体包括以下步骤：

预处理：鮸鱼鱼鳔经清洗、匀浆至糊状后，按照料液比1g:10-15mL加入0.1-0.12mol/LNaOH于4-6℃浸泡12-15小时，过滤，用蒸馏水洗至中性，按照料液比1g：5-8mL加入10-12%的异丙醇溶液，脱脂36-48小时，过滤，固体物用蒸馏水将异丙醇冲洗干净，干燥，得脱脂鮸鱼鱼鳔；先后使用碱浸提与醇脱脂，能够彻底除去鮸鱼鱼鳔中的多余脂肪，除去鮸鱼鱼鳔中的杂蛋白等杂质，提高蛋白质的含量，有助于进一步酶解反应的进行；

酶解：取脱脂鮸鱼鱼鳔，按料液比1g:5-8mL加入蒸馏水，调节pH值至9-10，加入鱼鳔重量2-3%碱性蛋白酶，碱性蛋白酶酶活力≥2.0×10⁵U/g，50-60℃酶解3-4小时，于90-100℃灭酶10-15分钟，冷却至室温后于12000-12500rmp离心15-20分钟，收集上清液，得鮸鱼鱼鳔酶解液；使用酶解法获取鱼鳔多肽，反应条件温和，制备成本较低，无毒副有机溶剂加入，碱性蛋白酶能够将脱脂鮸鱼鱼鳔酶解为小分子的高活性寡肽，而且不会破坏活性寡肽的成分与性质；

提取：将鮸鱼鱼鳔酶解液经截留分子量为10kDa和3kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于3kDa的组分，得到超滤酶解液；将超滤酶解液依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鮸鱼鱼鳔降血脂五肽；超滤与多级层析可以纯化鮸鱼鱼鳔降血脂五肽，提高成品中降血脂五肽的纯度，有利于鮸鱼鱼鳔降血脂五肽的精准应用，鮸鱼鱼鳔降血脂五肽能够有效地减少脂质的生成，其较低的分子量更易于被机体吸收，而且安全无毒副作用。

作为优选，预处理中的鮸鱼为Miichthy smiiuy。

作为优选，提取步骤中的离子交换树脂层析步骤为：将超滤酶解液用双蒸水配成浓度为45-55mg/mL的溶液，3-4℃、12000-12500r/min离心15-20分钟，去除不溶性杂质；取上清液加入到DEAE-52阴离子交换树脂层析柱，依次用蒸馏水、0.1mol/L、0.5mol/L和1mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.5mol/LNaCl洗脱组分，即为离子交换层析酶解物；离子交换树脂层析具有易操作、低成本的优点，可以将层析提纯放大为规模化生产。