[发明专利]一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体

说明书

本发明公开了一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体，属于基因工程和发酵工程领域。本发明以解脂耶氏酵母为宿主，构建了高产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌po1h/hpro‑mTG。该菌株产酶水平高，摇瓶发酵酶活可达11.7U/mL，较改造前提高了106倍，发酵罐发酵酶活可以达到43.7U/mL。通过共表达蛋白酶TAMEP和hpro‑mTG，实现了谷氨酰胺转氨酶的活性表达，摇瓶发酵酶活可达6.7U/mL，发酵罐发酵酶活达到21.4U/mL。本发明构建的重组菌发酵产酶水平高，可降低谷氨酰胺转氨酶的生产成本，利于谷氨酰胺转氨酶的工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体，属于酶工程领域。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase)，可以催化肽链中的谷氨酰胺残基中的γ-羧酰胺基与酰基受体发生转酰基反应，从而使蛋白质或多肽之间发生共价交联。TGase在食品加工领域的应用广泛，比如，TGase可使蛋白质与必须氨基酸(如赖氨酸)交联，提升一些食品的营养价值。TGase可以将碎肉粘结成块，提高肉制品的利用率，改善肉制品的弹性。此外，TGase在医药，化妆品，生物技术研究，纺织业及皮革加工等领域均有巨大的市场需求。

微生物具有生产成本低、易于培养和改造等优点，所以生产上主要依赖微生物来生产TGase。微生物来源的谷氨酰胺转氨酶通常以无活性酶原(pro-MTG)的形式分泌，需经蛋白酶dispase等切除N-端酶原区(pro)才能转化成活性MTG。酶原区(pro)位于信号肽与成熟酶之间，属于前导肽，对谷氨酰胺转氨酶的折叠和分泌具有重要的影响。有些链霉菌如Streptomyces lividans 3113、Streptomyces ladakanum等，其自身可以表达活化MTG的蛋白酶，因而可以表达活性MTG，但是MTG酶活相对较低，普遍在1.0-6.0U/mL。

近年来利用基因工程技术将谷氨酰胺转氨酶基因克隆至大肠杆菌等异源宿主中表达MTG成为了一种新的趋势，然而，一方面，大肠杆菌等异源宿主是非食品级表达体系，另一方面，在异源宿主中，谷氨酰胺转氨酶通常以无活性酶原的形式分泌，需在体外经蛋白酶TAMEP，SAM-P45，dispase等切除N-端酶原区(pro)才能转化成活性谷氨酰胺转氨酶。且重组菌生产谷氨酰胺转氨酶的产量普遍较低，如刘松的《Overproduction ofpro-transglutaminase from Streptomyces hygroscopicus in Yarrowia lipolytica andits biochemical characterization》中将吸水链霉菌来源的pro-TGase的突变体N355Q异源表达得到重组菌产量可达35U/mL，重组菌产谷氨酰胺转氨酶的产量有提升较小。因此，如何在食品级表达体系中稳定、的直接表达谷氨酰胺转氨酶，是目前亟待解决的问题。另外，如果在异源宿主中可以直接表达活性谷氨酰胺转氨酶，不仅可以简化生产步骤，还能降低生产成本，一举两得。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体。

本发明第一个目的是提供一种高效表达的谷氨酰胺转氨酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种高效表达所述突变体的重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以解脂耶氏酵母po1h为宿主。

本发明第三个目的是提供一种所述的重组菌的构建方法是，具体步骤如下：

(1)将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的酶原区谷氨酰胺转氨酶hpro基因融合后与载体连接，构建质粒pINA1297/hpro-mTG，所述茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2，所述吸水链霉菌来源的酶原区谷氨酰胺转氨酶hpro的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。