[发明专利]一种甜叶菊愈伤组织的获得方法

说明书

本发明属于植物细胞培养领域，具体涉及一种甜叶菊愈伤组织的获得方法。本发明提供的甜叶菊愈伤组织的获得方法包括将甜叶菊的气孔保卫细胞加以诱导培养、悬浮培养和愈伤组织诱导培养的步骤。本发明提供的甜叶菊愈伤组织的获得方法可以快速获得大量的表皮片段(含有气孔保卫细胞)，快速建立高纯度的悬浮细胞培养体系，缩短细胞筛选及培养时间，获得的愈伤组织质量高，胚性愈伤组织的百分率高，增重快。

技术领域

本发明属于植物细胞培养领域，具体涉及一种甜叶菊愈伤组织的获得方法。

背景技术

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)是菊科甜叶菊属植物，原产南美洲的巴拉圭，1976年从日本引进中国。现在，我国已成为世界上甜叶菊种植面积最大的国家，在江苏、福建、广东、浙江、山东、河南、安徽、新疆等地均有大面积种植。甜叶菊叶片富含甜叶菊糖苷、甜度高(为蔗糖的350-400倍)、热量低(为蔗糖的1/300)、安全无毒、被誉为“世界第三健康糖源”。中国卫生部于1985年和1990年分别批准甜叶菊糖苷为不限量使用的天然甜味剂和医药用甜味剂辅料。此外，甜叶菊糖苷具有控制血糖、降低血压、促进新陈代谢的作用，亦有治疗糖尿病、肥胖症、调节胃酸、恢复神经疲劳之功效。甜叶菊还可提升家畜、赛马和宠物食欲，治疗动物慢性病及牛不孕症，在畜牧和饲料生产上具有潜在应用价值。

甜叶菊因种子极小、千粒重低(约0.02g)，不宜于实生苗繁殖。组培快繁和悬浮细胞培养成为甜叶菊糖工厂化生产的主要措施。国内外早在二十世纪开展了甜叶菊离体培养研究，从种子、茎尖、叶片、叶柄和茎段等外植体均诱导出了愈伤组织。Ferreia等(FerreiraM.C，Handro W.Production，maintenance and plant regeneration from cellsuspension cultures of Stevia rebaudiana(Bert.)Bertoni.1988Plant CellReports，7(2):123-126)采用从甜叶菊诱导的愈伤组织建立悬浮培养，提高了甜叶菊细胞的繁殖速度；利用甜叶菊的悬浮细胞培养，有可能实现大规模工厂化生产甜叶菊糖苷。选用适宜的胁迫培养基，还能够提高悬浮细胞的甜叶菊糖苷含量5％以上。然而，甜叶菊愈伤组织的细胞类型混杂，特别是分裂能力和生长速度的差异大，需要很长的培养周期，才能筛选出纯度高、分裂力强、增殖速度快的悬浮细胞系。国内对甜叶菊细胞悬浮培养的研究和报道非常少，因此，研发有关快速建立高纯度、高含量甜叶菊糖苷悬浮培养细胞系的新技术是非常必要的。

气孔是植物与外界环境进行气体和水分交换的主要通道，通常由2个保卫细胞组成。保卫细胞多呈等径形、大小相近、核质比率大、胞质浓厚、细胞高度纯合，是建立悬浮细胞培养的理想外植体。然而，保卫细胞长期以来被认为是终端分化的特异细胞，丧失了分裂能力。目前，有关甜叶菊叶片气孔保卫细胞的分离和离体培养，国内外均无报道。目前的科研和实践中，均需要一种分离效率高、获得的细胞纯度高、悬浮培养细胞系的组建周期短的甜叶菊气孔保卫细胞的培养方法。

发明内容

本发明提供了一种甜叶菊愈伤组织的获得方法，该方法利用甜叶菊的气孔保卫细胞的分裂能力，将气孔保卫细胞经组织培养形成愈伤组织。

一种甜叶菊愈伤组织的获得方法，该方法包括将甜叶菊的气孔保卫细胞加以诱导培养、悬浮培养和愈伤组织诱导培养的步骤。

在优选的实施方式中，所述诱导培养包括将甜叶菊的表皮片段在诱导培养基中进行诱导培养，以获得小细胞团的操作；其中，所述诱导培养基为：以B5基本培养基为基础，添加蔗糖至最终的重量百分含量为2％-4％，添加6-BA至终浓度为0.5-5mg/L，添加NAA至终浓度为0.05-0.5mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度为100-200mg/L。