[发明专利]一种甜叶菊愈伤组织的获得方法

权利要求书

1.一种甜叶菊愈伤组织的获得方法，该方法包括甜叶菊的表皮片段的获取、将甜叶菊的气孔保卫细胞加以诱导培养、悬浮培养和愈伤组织诱导培养的步骤；

所述甜叶菊的表皮片段的获取操作为：

将甜叶菊无菌苗植株转移至新的栽培培养基中进行第一个继代培养周期的继代培养，然后转入新的栽培培养基中继续进行第二个继代培养周期的继代培养，接着再转入新的栽培培养基中继续进行第三个继代培养周期的继代培养，从上述三个继代培养周期的继代培养的甜叶菊中选取甜叶菊组织培养无菌植株；

将所述甜叶菊组织培养无菌植株的叶片片段浸泡于分离培养基中；

使用WARING分离器对浸泡于-20℃预冷的分离培养基中的甜叶菊组织培养无菌植株的叶片片段在1800转/分下运行1-5秒，再在22000转/分下运行10-30秒，获得分离产物；

将分离产物用100目的筛网进行过滤处理，收集获得表皮片段的过滤产物；

用所述分离培养基漂洗所述过滤产物，收集沉淀物，获得漂洗产物；

在4℃、1000rpm下离心处理所述漂洗产物，收集沉淀物，获得甜叶菊的表皮片段；

所述诱导培养包括将所述甜叶菊的表皮片段在诱导培养基中进行诱导培养，以获得小细胞团的操作；

所述诱导培养还包括两次添加加液培养基的操作；其中，

第一次添加加液培养基的操作为：在所述诱导培养的第7-10天，按照加液培养基和诱导培养基的体积比为(0.5-5):10的比例向诱导培养基中加入加液培养基；

第二次添加加液培养基的操作为：在所述诱导培养的第15-21天，按照加液培养基和诱导培养基的体积比为(1-5):10的比例向诱导培养基中加入加液培养基；

所述悬浮培养包括将经过所述诱导培养获得的小细胞团在悬浮培养基中进行悬浮培养的操作；

所述愈伤组织诱导培养包括将经过所述悬浮培养获得的小细胞团在愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养的操作；其中，

所述栽培培养基为：以MS基本培养基为基础，添加蔗糖至最终的重量百分含量为3％，添加琼脂至最终的重量百分含量为7％，添加6-BA至终浓度为0.1mg/L，添加NAA至终浓度为0.05mg/L；

所述分离培养基为：以1/2MS基本培养基为基础，添加6-BA至终浓度为0.2mg/L，添加蔗糖至最终的重量百分含量为3％，添加PVP-40至终浓度为1g/L，添加VC至终浓度为50mg/L；

所述诱导培养基为：以B5基本培养基为基础，添加蔗糖至最终的重量百分含量为2％-4％，添加6-BA至终浓度为0.5-5mg/L，添加NAA至终浓度为0.05-0.5mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度为100-200mg/L；

所述悬浮培养基为：以B5基本培养基为基础，添加蔗糖至最终的重量百分含量为2％-4％，添加6-BA至终浓度为0.05-0.50mg/L，添加NAA至终浓度为0.5-5mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度为100-200mg/L；

所述愈伤组织诱导培养基为：以MS基本培养基为基础，添加蔗糖至最终的重量百分含量为2％-4％，添加6-BA至终浓度为0.1-3.0mg/L，添加NAA至终浓度为0.5-5mg/L，添加琼脂至最终的重量百分含量为0.4％-1.0％；

所述加液培养基为：以B5基本培养基为基础，添加蔗糖至最终的重量百分含量为2％-4％，添加6-BA至终浓度为0.2-1.0mg/L，添加NAA至终浓度为0.2-0.8mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度为100-200mg/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述诱导培养在无光照条件下进行，培养的温度为20-30℃；

所述诱导培养的培养密度为0.1-1mL PCV/mL培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述悬浮培养在无光照条件下进行，培养的温度为20-30℃，培养周期为7-8天，共培养2-6个周期。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述悬浮培养为震荡培养。