[发明专利]一种有活性的天然蛋白质无载体运输方法及应用

说明书

本发明公开了一种有活性的天然蛋白质无载体运输方法，先利用生物模拟转氨反应对天然蛋白质进行修饰，即，天然蛋白质N末端在磷酸吡哆醛的作用下转化为醛，进而和羟胺通过形成肟而被荧光小分子修饰；修饰后的天然蛋白质自主运输进入细胞，实现多种药用天然蛋白质的无载体运输。本发明提供的无载体运输方法对不同天然蛋白及细胞系具有普适性，可用于多种天然蛋白和蛋白酶的无载体运输，这些外源性天然蛋白不仅可以提高胞内相关蛋白含量，达到治疗某些蛋白缺陷类治病的目的；还可以提高胞内某些酶的活力水平，调控活性氧物种相对含量，进而调控相关活性氧信号通路，在神经退行性疾病和癌症的研究和诊疗中具有重要意义和广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及蛋白质的运输方法，具体地指一种有活性的天然蛋白质无载体运输方法及应用。

背景技术

随着全球经济的快速发展、生活环境和健康观念的变化、慢性疾病发病率的年年攀升以及人口老龄化等因素影响，与人类生活质量密切相关的生物医药行业近年来一直保持了持续高速增长的趋势。根据全球知名的市场调研公司PMR发布的报告，全球生物药品市场将在2020年达到2871.4亿美元。随着医药研发的进步，市场上基于蛋白质的治疗药物的数量呈指数级增长。美国是生物工程产业的龙头，目前已批准近150个蛋白质药物上市，日本和欧洲是生物技术的重要发源地，目前已有几十种蛋白质药物批准上市，还有百余种蛋白质药物在临床试验当中。相比于国外，国内的蛋白质药物起步晚，研发相对滞后，但经过近几十年的发展，产业规模不断扩大，被列为国家“十二五”规划重点发展的领域之一。

较传统药物而言，蛋白质类药物具有高活性、高特异性、低毒性以及生物功能明确等优势，与此同时，大分子蛋白质类药物存在若干缺陷使其应用受到一定的限制，诸如生物安全性和利用率较低，半衰期短、生物活性不稳定，局限于静脉、皮下和肌肉注射等侵入式给药方式以及生产、贮运成本高等。因为大多数蛋白不能自发地进入动物细胞，使其在细胞实验、临床研究及应用方面临诸多困难。因此，发展安全，稳定和有效的蛋白质运输及释放系统变得至关重要。

通过化学转染，电穿孔，病毒或非病毒基因载体等方法将重组DNA或mRNA递送至胞内进而表达出相应蛋白是一种行之有效外源蛋白运输手段手段，但是却面临长效未知的安全风险，蛋白质的直接运输成为另外一种选择。早在1982年，Okada等人就报道了一种高渗作用介导的蛋白质运输方法，但是转染效率极低并且具有较大的细胞毒性。2000年Green和Frankel等人证明HIV TAT肽可以自主跨膜，后来进一步实验表明，将TAT和重组蛋白融合可以将目标蛋白运输至胞内，并且适用于几乎所有的细胞，从此细胞穿透肽(cellpenetrating peptide，CPP)受到广泛研究并应用于生物大分子的运输过程，但是CPP介导的蛋白运输依赖于目标蛋白的理化性质，并且会影响目标蛋白的功能及亚细胞定位。此外，抗体(Song et al,2015)，受体配体(Rizk et al,2009)，纳米微粒(Hasadsri et al,2009)及病毒样微粒(Voelkel et al,2010)也常常作为一种蛋白质运输手段，但是这些方法普适性较差并且需要高的蛋白剂量。

近几年，David R Liu研究团队详细研究了超电荷蛋白(Supercharged proteins，SCPs)的性质，功能及其应用，经改造的蛋白结构和功能不受影响，并且具有较高的转染效率，同时可作为其他生物大分子的运输载体。2015年，Niels Geijsen等人发展了一个名为“iTOP”蛋白运输系统，其中NaCl高渗作用介导的大胞饮，与其组合转染化合物(丙烷甜菜碱)共同促进蛋白质的胞吞作用。载体依赖型的蛋白质运输体系中载体的制备以及与目标蛋白的融合或连接均是相对复杂繁琐的过程，于此同时，超电荷蛋白的获得步骤复杂，需要突变和表达，“iTOP”系统利用NaCl介导的高渗作用会破坏细胞膜，导致细胞死亡。

因此，发展一种简单易行的普适性蛋白质无载体运输体系尤为重要。而且，非载体依赖的天然蛋白质运输体系尚未见报导。

发明内容