[发明专利]一种有活性的天然蛋白质无载体运输方法及应用

权利要求书

1.一种有活性的天然蛋白质无载体运输方法，其特征在于：先利用生物模拟转氨反应对天然蛋白质进行修饰，即，天然蛋白质N末端在磷酸吡哆醛的作用下转化为醛，进而和羟胺通过形成肟而被荧光小分子修饰；修饰后的天然蛋白质自主运输进入细胞，实现多种药用天然蛋白质的无载体运输。

2.根据权利要求1所述的有活性的天然蛋白质无载体运输方法，其特征在于：所述对天然蛋白质进行修饰的具体步骤如下：

1)称取天然蛋白质溶于磷酸盐缓冲溶液中，形成蛋白质溶液，按天然蛋白质与磷酸吡哆醛的摩尔比1：200称取磷酸吡哆醛溶于同等体积的磷酸盐缓冲溶液，并与所述蛋白质溶液混合，室温搅拌反应18h；

2)将反应后的混合溶液离心浓缩，通过分离纯化除去未反应完的磷酸吡哆醛，得到磷酸吡哆醛修饰后的蛋白质，命名为Protein-PLP；

3)取标定蛋白浓度后的Protein-PLP，溶于磷酸盐缓冲溶液中，再按Protein-PLP与化合物4(Ⅰ)的摩尔比1:50加入化合物4(Ⅰ)，室温下搅拌反应18h；

4)将反应后的混合溶液离心浓缩，通过分离纯化除去未反应完的化合物4(Ⅰ)，得到荧光标记修饰后的蛋白质，命名为Protein-RhB(Ⅱ)；反应式如下：

3.根据权利要求2所述的有活性的天然蛋白质无载体运输方法，其特征在于：所述化合物4(Ⅰ)的制备方法包括以下步骤：

1)N-羟基氨基甲酸叔丁脂溶于乙腈中，缓慢加入1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，补加乙腈；再加入1,6-二溴己烷，补加乙腈；在室温下反应3h后向反应器中补加1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，室温反应2h，升温至50℃，搅拌回流；反应结束后减压浓缩，接着溶解于乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂中，硅藻土过滤，再浓缩得到粗产品并通过柱色谱分离纯化，得到化合物1；

2)哌嗪溶解于四氢呋喃中，加热搅拌回流；将步骤1)得到的化合物1溶解于四氢呋喃中，缓慢加入反应器，回流搅拌过夜；抽滤除去固体，滤液旋干，用无水乙醚和饱和氯化钠溶液分层，水层用无水乙醚萃取三次，合并有机层用无水MgSO4干燥，浓缩得到化合物2；

3)将罗丹明B与苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯溶解于二氯甲烷中，加入N，N-二异丙基乙胺；室温搅拌后，加入步骤2)得到的化合物2；薄层色谱检测反应进程，待反应完成，加入去离子水，接着用二氯甲烷萃取5次，合并有机层，浓缩得到粗产品并通过柱色谱分离纯化，得到化合物3；

4)将步骤3)得到的化合物3溶解于三氟乙酸：二氯甲烷混合溶剂中，室温反应0.5h后，旋转蒸发除去溶剂，重复以上步骤，通过薄层色谱法监测反应进程，直至反应完全，得到化合物4(Ⅰ)。

4.一种根据权利要求1～3之一所述的有活性的天然蛋白质无载体运输方法在调控胞内相关活性氧物种水平方面和相关药物研发中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述活性氧为O2·-及H2O2。

6.根据权利要求1～3之一所述的有活性的天然蛋白质无载体运输方法在神经退行性疾病和癌症治疗方面的应用。