[发明专利]褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物、试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物及其检测方法和检测试剂盒。

背景技术

沃尔巴克氏体作为一种母系遗传的专性胞内共生菌，广泛存在于大量的节肢动物体内。已有的研究表明，在全世界范围内，理论上约有60％的昆虫感染了沃尔巴克氏体。沃尔巴克氏体不仅可以在寄主体内诱导胞质不亲和(Cytoplasmic Incompatibility，CI)表型达到种群压制效果，同时也能通过其所推动的种群替换达到阻断虫媒病毒的作用。CI是指当感染一种沃尔巴克氏体的雄虫与不感染沃尔巴克氏体的雌虫或感染不同株系沃尔巴克氏体的雌虫交配时所产后代胚胎的死亡，从而表现为成虫的不育。

在防治目标区域内，持续地释放经人工转染的沃尔巴克氏体所修饰而具有诱导CI能力的白纹伊蚊Aedes albopictus雄虫与野外的雌虫交配，可以达到快速压制野生种群效果。与此同时，与传统农药相比，基于沃尔巴克氏体的防治策略具有靶标专一性的优势，大大减少了对生态系统中其他生物群落的影响，对环境的破坏程度也大大降低。

通过人工转染的方式，将这样一种垂直传播的共生菌水平地从原始寄主转入一个新寄主体内，并使其稳定遗传下去，从而建立一个新的感染品系，作为防治其野生种群的供体的过程，是沃尔巴克氏体应用研究中最为关键的一部分。大量的研究表明，在实验室条件下利用显微注射技术能够成功地实现沃尔巴克氏体在不同寄主之间的水平转染。一旦进入新的寄主，Wolbachia往往可以不同程度地影响寄主的表型，比如表达CI、提高寄主的抗病毒能力以及缩短寄主寿命等等。已经有研究表明综合利用沃尔巴克氏体所诱导的表型，可以成功通过种群替换的方式阻断登革病毒的传播。

稻飞虱作为一种重要的农业害虫，对我国首要的粮食作物——水稻的生产造成了极大的危害。除了造成水稻的减产甚至部分田块的绝收，每年由于对其防治造成的经济损失也十分惊人。其中，褐飞虱Nilaparvata lugens作为一种单食性(仅取食水稻和野生稻)长距离迁飞害虫，凭借其刺吸、产卵以及传毒等为害方式，每年都可以在我国造成百万吨计的产量损失。考虑到化学杀虫剂的长期使用带来的抗性会无法避免地降低其对稻飞虱的防治效果，新的防治手段的研究与开发一直是科学家们所关注的热点问题，也符合有害昆虫综合治理(IPM)的总体方针。

我国危害水稻的稻飞虱主要有三种：褐飞虱和灰飞虱和白背飞虱三种，其中以褐飞虱发生和为害最重。目前针对飞虱沃尔巴克氏体的检测是通过PCR来完成的。而且只能检测出飞虱通用类型的沃尔巴克氏体，由于不同飞虱携带不同类型的沃尔巴克氏体，所以找到特异性的检测引物和检测方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种专一性强、特异性高和灵敏度高的褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物。

实现上述目的的技术方案如下。

本发明的褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物，其上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一目的是提供一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测方法。

实现该目的的技术方案如下。

一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测方法，包括以下步骤：

(1)先把褐飞虱在无水酒精里浸泡，提取样品DNA；

(2)加入样品DNA稀释10倍为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2作为PCR引物，进行PCR扩增。

优选地，扩增时加入的样品DNA的浓度为是50×10^-1-30×10^-4ng/μl。

所述的进行PCR扩增，其反应条件优选为：94℃预变性5分钟；95℃变性5秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒，30个循环；72℃最后延伸5分钟。

本发明的另一目的是提供一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测试剂盒。

一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测试剂盒，包括检测引物和PCR试剂，所述的检测引物为：

wLugF：5’-GGCTGATAATCCAGCAATTGC-3’；

wLugR：5’-AAA AATTAAACGCTACTCCA-3’。

优选地，还包括有褐飞虱的DNA提取试剂，DNA提取试剂包括有稀释缓冲液和DNARelease。

优选地，所述稀释缓冲液为：30mM NaOH、0.25mM EDTA、15mMTris-HCl，溶剂为

水；每20μl稀释缓冲液中加入0.5μl DNARelease。