[发明专利]一种乳酶生菌种中脂肪酸组分的检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，尤其是涉及一种乳酶生菌种中脂肪酸组分的检测方法及应用。

背景技术

乳酶生(别名：表飞鸣)为乳酸菌制剂，是一种助消化药，用于治疗肠内异常发酵引起的肠胀气、消化不良引起的腹泻等。现收载于《中华人民共和国药典》2015版二部，其生产过程应符合微生态活菌制品总论项下的要求，生产用菌种需进行脂肪酸测定。脂肪酸是生物体的基本结构成分之一，在细胞中绝大部分脂肪酸以结合形式存在，构成具有重要生理功能的脂类，它们是构成生物膜的重要物质。现代微生物学研究表明：细菌的细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与细菌的DNA具有高度的同源性，不同种属的细菌，其脂肪酸的组成和含量表现出不同程度的差异，并且这种差异是比较稳定的，各种细菌具有其特征性的细胞脂肪酸指纹图谱，并且脂肪酸分析可区分属、种并进行聚类，其结果与16S rRNA基因序列分析有较好的一致性。目前尚无乳酶生菌种中检测脂肪酸组分的方法，而且菌种脂肪酸组分复杂，难以分离，传统方法步骤繁琐，所需样品量大等问题，方法不适用于推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提出一种乳酶生菌种中脂肪酸组分的检测方法及应用，在种的水平上对生产菌种进行同源性比对及基源鉴定，本方法具有不需要探针、操作简单、检测时间短，分析方便。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种乳酶生菌种中脂肪酸组分的检测方法，包括以下步骤：

(1)菌体的收集和干燥

将标准菌株及由乳酶生片分离得到的菌株转接入100mL MRS培养基中，37℃培养48h～72h，于4 000r·min^-1离心10min，离心温度5～15℃，倒去上清液，用去离子水反复洗涤2～5次，得到的菌体于60℃真空干燥3h，干燥菌体置于干燥器中，备用；

(2)脂肪酸甲酯化

精密称取干燥菌体和脂肪酸对照品各50mg分别于螺口试管中，向试管加入14％三氟化硼-甲醇或1％硫酸-甲醇溶液1～5mL，立即充入N₂密封并进行超声波震荡5～15min，置于60～80℃水浴25～40min，取出后加入2mL正己烷，震荡2～5min，取上清液，再用1mL正己烷洗涤，合并上清液，用0.22μm滤膜过滤于干净进样瓶中，用于气相色谱-质谱分析；

(3)气相色谱-质谱的条件

色谱条件：色谱柱为非极性柱，载气为氦气，进样口温度250℃，进样量为1μl，进样分流比10:1，流量1.0mL·min^-1，程序升温为120℃保持5min，然后以6℃·min^-1升温至240℃，保持10min，再以10℃·min^-1升温至260℃，保持2min；

质谱条件：离子源EI，电子能量为70eV；溶剂延迟3min；EMV模式为增益系数1，扫描方式为全扫描方式，m/z为35～450；采样频率为2；

(4)数据分析及样品鉴定

经过步骤(3)后，根据获得的原始光谱数据，计算检测样品内各脂肪酸组分的相对含量。

进一步的，所述步骤(1)中标准菌株为粪肠球菌140623(中国食品药品检定研究院，乳酶生生产用)，粪肠球菌CGMCC1.2135、海氏肠球菌CGMCC1.595、屎肠球菌CGMCC1.131(中国普通微生物菌种保藏管理中心)，屎肠球菌CICC21605、粪肠球菌CICC23658(中国工业微生物菌种保藏管理中心)，乳酶生片20批，分别来源于6家生产企业。

进一步的，所述步骤(1)中乳酶生片分离菌株的步骤如下：

取样品10g，加0.9％无菌氯化钠溶液制成100ml，加适量无菌玻璃珠，摇匀，制成1：10的混悬液，用0.9％无菌氯化钠溶液梯度稀释。取3个连续适宜稀释度的混悬液1ml，置无菌平皿中，每稀释级至少2个平皿。注入15～20ml温度不大于45℃的1％碳酸钙含糖牛肉琼脂培养基，混匀，凝固，倒置，于37℃培养48小时，挑取有透明圈的单菌落划平板，分离培养得到目标菌株。

进一步的，所述步骤(2)中14％三氟化硼-甲醇或1％硫酸-甲醇溶液加入量为2mL。

进一步的，所述步骤(2)中脂肪酸对照品为C₄～C₂₄的脂肪酸甲酯混合对照品。

进一步的，所述步骤(3)中色谱柱为HP-5MS色谱柱。