[发明专利]一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法。

背景技术

龋病被世界卫生组织(WHO)列为严重危害人类健康的流行性感染性疾病之一，是在细菌等多种因素共同作用下，牙齿硬组织发生的慢性、进行性、破坏性疾病。致龋的因素包括：细菌、食物、宿主和作用时间等。口腔内细菌种类甚多，其中主要是厌氧菌和兼性厌氧菌，包括链球菌属、乳杆菌属和放线菌属等。变形链球菌在口腔中检出率高，接近90％，是主要的致龋菌，它通过黏附、产酸和耐酸等致使牙体硬组织破坏，从而导致龋齿的形成。

口含型无烟气烟草制品是一种湿润的烟草粉末制品，起源于19世纪瑞典。瑞典口含烟产品呈现细的颗粒状，含水量通常在40％以上，含水量低于40％的半干制品也有售。产品放在上唇与牙龈之间，使用时不需要唾出唾液，有散装和袋装产品。在产品使用的过程中，产品对人口腔健康的影响是一个重要考察指标。目前的烟草制品仅针对产品本身进行一些物理化学指标的检测，而对人口腔中的微生物影响研究较少，尤其是针对口腔中变形链球菌的研究未曾涉及。因此如何克服现有技术的不足是目前生物检测技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，该方法首先配制含有变形链球菌的人工唾液，并针对口含型产品的使用特点，采用人工唾液模拟口含型烟草制品的使用过程，并对唾液的变形链球菌含量进行荧光定量PCR分析，从而考察在使用口含型烟草制品前后唾液中的变形链球菌含量的变化，为口含型烟草制品的口腔健康提供参考。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，包括如下步骤：

步骤(1)，配制人工唾液，并向人工唾液中添加变形链球菌，使变形链球菌在人工唾液中的量为1*10⁴-1*10⁶CFU/mL，得到含变形链球菌的人工唾液；

步骤(2)，采用步骤(1)得到的含变形链球菌的人工唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；

步骤(3)，将步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的变形链球菌DNA，同时提取变形链球菌的标准菌株原始DNA；

步骤(4)，以浓度梯度稀释10倍的变形链球菌的标准菌株原始DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，之后绘制变形链球菌荧光定量PCR标准曲线；

同时，分别以各培养液中的变形链球菌DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各培养液中的变形链球菌DNA的含量；

其中，荧光定量PCR分析所使用的上游引物为5’-gcctacagctcagagatgctattct-3’；下游引物为5’-gccatacaccactcatgaattga-3’；探针为FAM-tggaaatgacggtcgccgttatgaa-TAMRA。

进一步，优选的是，步骤(2)的具体方法为：

向口含烟烟草制品0.8-1.2g中注入步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液于37℃下恒温震荡进行提取，提取多次，每次提取所用的含变形链球菌的人工唾液10mL，每次提取时间为5min，分别收集提取液。

进一步，优选的是，所述的震荡速度为150-300rpm；提取次数为3次。

进一步，优选的是，步骤(3)的具体方法为：

(3.1)共培养：取步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；

(3.2)培养液中的变形链球菌DNA的提取：取出步骤(3.1)的培养后的培养液在4℃离心，去上清液，再加入微生物PCR裂解液，混合均匀后，置于75-85℃下热变性15min，然后再次离心，取上清液，即得到培养液中的变形链球菌DNA；所述的微生物PCR裂解液的加入体积为培养液体积的5％；

(3.3)变形链球菌的标准菌株原始DNA的提取：取与步骤(3.2)所使用的相同体积的微生物PCR裂解液，加入变形链球菌的标准菌株至浓度为10⁷CFU/mL，在75-85℃下热变性15min，然后离心，取上清液，即得到变形链球菌的标准菌株原始DNA；