[发明专利]一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法

权利要求书

1.一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），配制人工唾液，并向人工唾液中添加变形链球菌，使变形链球菌在人工唾液中的量为1*10⁴-1*10⁶CFU/mL，得到含变形链球菌的人工唾液；

步骤（2），采用步骤（1）得到的含变形链球菌的人工唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；

步骤（3），将步骤（2）收集到的各提取液与步骤（1）的含变形链球菌的人工唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的变形链球菌DNA，同时提取变形链球菌的标准菌株原始DNA；

步骤（4），以浓度梯度稀释10倍的变形链球菌的标准菌株原始DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，之后绘制变形链球菌荧光定量PCR标准曲线；

同时，分别以各培养液中的变形链球菌DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各培养液中的变形链球菌DNA的含量；

其中，荧光定量PCR分析所使用的上游引物为5’-gcctacagctcagagatgctattct-3’；下游引物为5’-gccatacaccactcatgaattga-3’；探针为FAM-tggaaatgacggtcgccgttatgaa-TAMRA。

2.根据权利要求1所述的口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，步骤（2）的具体方法为：

向口含烟烟草制品0.8-1.2g中注入步骤（1）的含变形链球菌的人工唾液于37℃下恒温震荡进行提取，提取多次，每次提取所用的含变形链球菌的人工唾液10mL，每次提取时间为5min，分别收集提取液h。

3.根据权利要求2所述的口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，所述的震荡速度为150-300 rpm；提取次数为3次。

4.根据权利要求2所述的口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，步骤（3）的具体方法为：

（3.1）共培养：取步骤（2）收集到的各提取液与步骤（1）的含变形链球菌的人工唾液，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；

（3.2）培养液中的变形链球菌DNA的提取：取出步骤（3.1）的培养后的培养液在4℃离心，去上清液，再加入微生物PCR裂解液，混合均匀后，置于75-85℃下热变性15min，然后再次离心，取上清液，即得到培养液中的变形链球菌DNA；所述的微生物PCR裂解液的加入体积为培养液体积的5%；

（3.3）变形链球菌的标准菌株原始DNA的提取：取与步骤（3.2）所使用的相同体积的微生物PCR裂解液，加入变形链球菌的标准菌株至浓度为10⁷ CFU/mL，在75-85℃下热变性15min，然后离心，取上清液，即得到变形链球菌的标准菌株原始DNA；

所述的微生物PCR裂解液为Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR。

5.根据权利要求4所述的口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，（3.2）中培养液的离心的转速为11000-12000r/min，时间为10min；热变性后离心的转速为800-1000r/min，时间为1min。

6.根据权利要求4所述的口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，（3.3）中热变性后离心的转速为800-1000r/min，时间为10s。

7.根据权利要求1或4所述的口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，在进行荧光定量PCR分析前需要对变形链球菌的标准菌株原始DNA、各培养液中的变形链球菌DNA的纯度判定，判定方法是：将待测样品的DNA分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.7~1.9时，表明纯度合格，能进行荧光定量PCR分析，反之，则表明纯度不合格，不能进行荧光定量PCR分析。