[发明专利]一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，包括Aml、(ACT)₆、(GAA)₆、(TTG)₆四种探针，其中所述Aml探针由51个碱基对组成，其碱基序列为：5′- GATCCATGTGTGGTTTGTGGAAAGAACACACATGCAATGACTCTAGTGGTT -3′，用于特异性识别燕麦属C基因组所有染色体；所述(ACT)₆探针的碱基序列为：5′- ACTACTACTACTACTACT -3′，用于识别偏好C基因组部分染色体的部分结构，也微弱识别A染色体组部分染色体的部分结构；所述(GAA)₆探针的碱基序列为：5′- GAAGAAGAAGAAGAAGAA -3′，用于识别偏好A和C基因组部分染色体的部分结构；所述(TTG)₆探针的碱基序列为：5′- TTGTTGTTGTTGTTGTTG -3′，用于识别偏好A基因组部分染色体部分结构，微弱识别C基因组部分染色体的部分结构。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，所述Aml探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，所述(ACT)₆探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。

4.根据权利要求1所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，所述(GAA)₆探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。

5.根据权利要求1所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，所述(TTG)₆探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。

6.一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，其特征在于，包括：

（1）权利要求1~5任意一项所述的探针组；

（2）酶解液；

（3）4%多聚甲醛液；

（4）2×SSC缓冲液；

（5）70%FA液；

（6）杂交液；

所述杂交液由等体积的1×TE和2×SSC缓冲液组成；其中1×TE的配制方法为：每800mL的ddH₂O中加入1.211g Tris和0.372g EDTANa₂•2H₂O，用HCl调pH到8.0，定容到1000mL，灭菌后即得。

7.根据权利要求6所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，其特征在于，所述酶解液的配制方法为：每1mL的柠檬酸缓冲液中加入0.04g纤维素酶和0.02g果胶酶；其中柠檬酸缓冲液的配制方法为：每50mL的ddH₂O加0.5707g柠檬酸三钠和0.4324g柠檬酸。

8.根据权利要求6所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，其特征在于，所述2×SSC缓冲液的配制方法为：每1000mL的ddH₂O加入8.823g柠檬酸三钠和17.532g氯化钠。

9.根据权利要求6所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，其特征在于，所述70%FA液由去离子甲酰胺(FA)和2×SSC缓冲液按照体积比7:3组成。

10.一种用于检测燕麦属植物染色体的方法，是采用权利要求6~9任意一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：

1）燕麦属植物染色体载玻片标本的制备：将燕麦属植物种子用双蒸水浸泡，置于4℃环境中放置24h，吸去多余水分，并于22℃恒温培养，待根尖长至1.5～2.0cm时，剪取1～1.5cm根尖组织，依次用N₂O处理5h、冰醋酸处理5min，然后置于75%酒精中于-20℃保存；

将低温保存的根尖组织以双蒸水清洗后切取根尖分生组织1～2mm，置于酶解液中于37℃酶解45min，去除酶解液，依次用双蒸水、75%酒精、95%酒精、100%酒精清洗根尖分生组织后室温晾干；在根尖组织中加入冰醋酸制成悬浮液；将悬浮液滴于载玻片上室温晾干后镜检，镜检良好的玻片于-20℃保存；

2）荧光原位杂交：将载玻片置于4%多聚甲醛中处理10min，然后用2×SSC缓冲液处理两次，每次5min，再依次用75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度处理，每次5min，室温晾干后滴加70%FA液，盖上盖玻片，于80℃变性2min；

载玻片变性完成后于5s内依次放入-20℃的75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度处理，每次5min，室温晾干；在晾干的载玻片上滴加放有探针的杂交液，每张载玻片滴加10μL放有探针的杂交液，其中每种探针含有0.5μL，剩余为杂交液；盖上盖玻片，于黑暗条件下在杂交盒中于37℃恒温孵化1.5～2h；

将孵化完成的载玻片在避光条件下依次用2×SSC缓冲液清洗3min、双蒸水清洗2min，室温晾干；

3）信号检测：晾干后的载玻片上加入DAPI，盖上盖玻片，采用荧光显微镜对载玻片进行检测，采集检测图像；

4）载玻片回收：信号采集之后回收制片并放入2×SSC缓冲液中于60℃水浴5min，依次在75%酒精、95%酒精、100%酒精中梯度处理，每次5min，处理完成后将回收制片于日光灯下放置12h；-20℃保存以备下次使用。