[发明专利]一种可再生毛囊的皮肤再生材料及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因活性组织工程支架的制备方法，尤其涉及一种可再生毛囊的皮肤再生材料及其制备方法，具体涉及利用肝细胞生长因子质粒DNA(简写为HGF-pDNA或pDNA-HGF)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)制备负载干细胞的基因活性组织工程支架的方法。

背景技术

皮肤缺损特别是大面积皮肤缺损，对人类的健康有极大的威胁。作为传统治疗手段“皮肤移植”的替代者，组织工程与再生医学产品发展势头强劲。尽管已经商业化的组织工程与再生医学产品能够修复损伤的表皮和真皮组织，但再生皮肤组织的功能化还没有得到完全解决，特别是皮肤附属器官的缺失对皮肤组织功能的恢复有极大影响。如何在再生表皮和真皮组织的同时再生出附属器官结构是皮肤组织工程与再生医学的重点。基因活性支架材料是将外源性基因与支架结合起来构建的复合体系。外源性基因取代生长因子使基因活性支架能够维持生长因子更长时间、更稳定的释放。同时基因载体的存在使基因能够在局部释放，使生长因子的作用更加有针对性。基因活性支架的核心是构建合适的支架体系，支架作为基因的暂时存储空间，在合适的时间和地点释放基因。一般需要选择特定的基因载体或者对基因载体改性使其能够与支架体系融合。

胶原和壳聚糖是天然高分子材料，作为支架材料，他们被广发的应用于组织工程领域。本课题组前期开发了一种胶原壳聚糖复合支架材料，该复合支架具有良好的生物相容性，可作为再生材料用于皮肤缺损的修复。体外试验证明该复合支架材料可以促进成纤维细胞的粘附。体内试验表明该支架材料能有效诱导真皮的再生，控制挛缩，提高创面愈合速度，增加创面愈合后皮肤的弹性、柔软性及机械耐磨性，降低疤痕组织的形成。胶原壳聚糖复合支架是一种有效的、具有重要潜在应用价值的皮肤再生材料。

一些研究已经证实肝细胞生长因子(HGF)能够诱导干细胞向毛囊方向分化，因此选取HGF作为诱导毛囊分化的因子。为了充分发挥HGF的作用，将基因工程引入支架体系，基因转染细胞之后能够持续有效表达HGF，从而避免了裸HGF在体内不可控释放及被生理环境中的酶降解。利用商业化的脂质体与编码HGF的质粒DNA结合形成复合纳米粒子，以保护质粒DNA的活性，提高转染效率。将纳米粒子与胶原壳聚糖支架复合制备基因活性支架。

作为组织工程的三要素之一，种子细胞是组织工程与再生医学的关键。前期研究者的很多探索表明毛囊部位提取细胞如毛乳头细胞，毛囊外根鞘细胞等细胞的混合细胞具有再生毛囊结构的能力，但这些细胞来源有限、提取困难、需细胞混合等，在组织工程与再生医学中不具有可行性。而近年来快速发展的干细胞技术为解决这一问题提供了方案。干细胞特别是骨髓间充质干细胞来源广泛，提取容易，具有多分化潜能，在毛囊这种结构复杂的组织再生中具有独特优势。干细胞的分化需要一个合适的诱导环境，而伤口组织的毛囊结构缺失，生理环境遭到破坏，已不足以诱导植入的干细胞分化为毛囊再生所需的各种组织特异性细胞。固本发明导入外源性的骨髓间充质干细胞，利用肝细胞生长因子(HGF)质粒DNA表达HGF，进而诱导干细胞向毛囊方向分化。

发明内容

本发明的目的是提供一种可再生毛囊的皮肤再生材料及其制备方法，该材料是负载骨髓间充质干细胞的基因活性支架材料，是利用胶原壳聚糖支架材料结合肝细胞生长因子质粒DNA(HGF-pDNA)以及骨髓间充质干细胞，简便易行地制备具有良好生物相容性，诱导毛囊再生的基因活性组织工程支架材料。

本发明的可再生毛囊的皮肤再生材料，是由胶原-壳聚糖多孔支架、骨髓间充质干细胞(BMSC)以及基因载体/表达肝细胞生长因子的质粒DNA(pDNA-HGF)纳米粒子组成；所述的基因载体/pDNA-HGF纳米粒子、BMSC通过多点注射的方法先后注入胶原-壳聚糖多孔支架中。

所述的骨髓间充质干细胞采用二代BMSCs。所述的基因载体是脂质体、高分子基因载体或病毒基因载体。

本发明的可再生毛囊的皮肤再生材料的制备方法，包括以下步骤：

1)将500μg/mL的pDNA-HGF质粒溶液，按照DNA(μg)：基因载体(μL)＝1:2的比例混合，制备基因载体/pDNA-HGF纳米粒子悬液；