[发明专利]一种优化的人脐静脉血管内皮细胞获取方法

说明书

本发明公开了一种脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)的获取方法包括了细胞的原代分离、扩增、冻存方法，属于生物技术领域。包括以下步骤：在室温下，用预热的I型胶原酶灌注脐静脉，消化收集得到HUVEC，然后进行培养扩增冻存，该方法不会造成过度消化组织，同时避免了环境和其它杂细胞的污染风险。本发明操作简单，安全，获得的细胞纯度较高，易于向临床用细胞的生产转化，可建立一种稳定的细胞分离、扩增及储存体系，为内皮细胞库的建设提供技术基础。

技术领域

本发明为HUVEC的获取方法包括了原代分离及扩增、冻存方法，属于生物技术领域。

背景技术

作为血管内壁的重要组成部分，HUVEC在血液与组织的物质交换中起关键作用，具有屏障、信息的传递和内分泌、参与血管形成等多种生理功能。而其结构与功能的异常会导致多种血管类疾病的发生，如血管粥样硬化、血栓、脑血管病、糖尿病等。因此对HUVEC研究将会为缺血性疾病的治疗及血管组织工程提供重要的帮助。

从新生儿脐带中分离得到的内皮细胞是广泛用于实验研究的血管内皮细胞，可作为研究某些病理状态的模型，亦可作为组织工程的种子细胞。本实验应用胶原酶消化法进行HUVEC的原代分离，获得高质量高纯度的内皮细胞，建立了一种稳定的细胞分离、扩增及冻存方法，以用于血管内皮细胞的相关研究。

目前HUVEC的分离方法包括胶原酶灌注消化法、静脉管组织块贴壁法和静脉管组织块消化法。最常用胶原酶灌注消化法，得到的细胞纯度较高，但这一消化过程在37℃水浴条件下，为半封闭的环境，易污染。内皮细胞为血管内壁的单层细胞，难以把控消化时间，易对较细小的血管组织消化过度，在未来的临床用细胞的生产中具有局限性。因此需要对当前的原代分离方法进行优化，建立一种操作简单、过程可控的内皮细胞原代分离方法。

发明内容

本发明研究一种优化的HUVEC的获取方法包括了分离及扩增、冻存的方法，可为临床和研究提供高纯度的内皮细胞资源。

本发明所提供的HUVEC分离方法中，Ⅰ型胶原酶的配制方法为50mlDMEM基础培养基中加入0.05gⅠ型胶原酶，0.22μl滤器过滤后使用。

优选地，Ⅰ型胶原酶的终浓度为0.1%，使用体积为0.4ml/cm长血管；消化时间为40min。

优选地，消化的操作过程在生物安全柜内进行，所需Ⅰ型胶原酶和生理盐水需提前预热至37℃。

消化得到的细胞，在培养12-24h后进行第一次全量换液，以去除未贴壁的细胞与组织。

具体地说，血管内皮细胞培养中使用的完全培养基，该培养基是DMEM/F12，低浓度胎牛血清(2%)，hEGF，皮质醇，庆大霉素和两性霉素B，hVEGF，hFGF-B，R3 -IGF-1，抗坏血酸，以及肝素钠组成。

优选地，HUVEC后以1.1×10⁴/cm²的密度接种传代，放入37℃、5%CO₂的饱和湿度的培养箱中进行培养。

优选地，细胞的冻存密度为1×10⁶~1×10⁷/ml。

优选地，冻存液的成分构成为完全培养基+10%人血白蛋白+10%DMSO。

本发明提供了以下的技术方案：

（1）原代分离：采集取足月新生儿脐带，使用Ⅰ型胶原酶灌注整个脐静脉，用脐带夹夹住两端端口；在15cm培养皿中，用预热的生理盐水浸泡整根脐带，消化35~45min。消化完后，将消化液及后续的清洗液一并收集于离心管，400g,离心8min；离完心后使用4ml血管内皮细胞完全培养基重悬细胞沉淀，接种于1个T25中，置于5% CO₂饱和度的37℃培养箱中静置培养；