[发明专利]一种优化的人脐静脉血管内皮细胞获取方法

权利要求书

1.本发明主要是一种HUVEC的获取方法包括了原代分离、扩增及储存方法，其特征在于，包括了以下步骤：

（1）原代分离：采集取足月新生儿脐带，使用Ⅰ型胶原酶灌注整个脐静脉，用脐带夹夹住两端端口；在15cm培养皿中，用预热的生理盐水浸泡整根脐带，消化35~45min，消化完后，将消化液及后续的清洗液一并收集于离心管，400g,离心8min；离完心后使用4mlHUVEC完全培养基重悬细胞沉淀，然后接种于1个T25中，置于5% CO₂饱和度的37℃培养箱中静置培养；

（2）细胞扩增：细胞培养12-24h后进行第一次全量换液以除去未贴壁的细胞及残余组织，以后每3天换液，直至细胞生长汇合至80%以上，进行细胞传代，细胞使用生理盐水洗涤2次，使用37℃预热的TrypLE消化细胞，细胞收集后离心、重悬、计数，按照1.1×10⁴/cm²接种至T175，按照25ml /瓶，加入完全培养基；

（3）细胞冻存：配制冻存液，冻存液的成分为完全培养基+10%人血白蛋白+10%DMSO，4℃预冷备用，收集生长对数期的P3细胞进行冻存，细胞收集过程步骤同传代，离心完的细胞沉淀用冻存液重悬，调整细胞浓度为1×10⁶~1×10⁷/ml，将细胞悬液分装到冻存管里，转入-80℃冰箱，次日转入液氮罐冻存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中使用的Ⅰ型胶原酶的配制方法为50mlDMEM基础培养基中加入0.05gⅠ型胶原酶，0.22μl滤器过滤后使用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中Ⅰ型胶原酶的终浓度为0.1%，使用体积为0.4ml/cm长血管；消化时间为40min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于消化的操作过程在生物安全柜内进行，所需Ⅰ型胶原酶和生理盐水需提前预热至37℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）细胞培养12-24h后进行第一次全量换液。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于所述的HUVEC培养中使用的完全培养基，该培养基是DMEM/F12，低浓度胎牛血清(2%)，hEGF，皮质醇，庆大霉素和两性霉素B，hVEGF，hFGF-B，R3 -IGF-1，抗坏血酸，以及肝素钠组成。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）传代过程中，HUVEC以1.1×10⁴/cm²的密度接种，然后放入37℃、5%CO₂的饱和湿度的培养箱中进行培养。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）细胞的冻存密度为1×10⁶~1×10⁷/ml。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：冻存液的成分构成为完全培养基+10%人血白蛋白+10%DMSO。