[发明专利]可共价结合底物的标签蛋白在CLIP中的应用

说明书

本发明公开了一种可共价结合底物的标签蛋白在CLIP中的应用。本发明提供了使用可共价结合底物的标签融合蛋白通过变性剂纯化方式在CLIP技术中的应用。本发明使用可共价结合底物的标签的融合蛋白通过蛋白变性试剂洗涤的方式得到可以用于测序的RNA文库，结果证明可以很好地重复以前的文献发表的实验结果。在操作上省略了传统CLIP步骤中需要通过转膜并且切胶回收片段的步骤。该方法通过可共价结合底物的标可和固定于介质上的特异性结合物形成共价键的特性，将传统上不能在磁珠上直接进行的剧烈洗涤方法加入到实验操作步骤中。这样在操作上比较简便，节省了操作时间，优化了CLIP步骤，减少了操作过程中可能会造成的损失。

技术领域

本发明属于RNA生物学以及分子生物学领域，涉及一种可共价结合底物的标签蛋白在进行CLIP(cross-linking immunoprecipitation，紫外交联免疫共沉淀)实验中的应用，具体涉及CLIP技术中，使用带有可共价结合底物的标签的融合蛋白，通过变性试剂洗涤的方式纯化蛋白-RNA共价交联复合物，从而省略了SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺)电泳、醋酸纤维素转膜或同位素标记等步骤，最终得到可以用于测序的cDNA文库。

背景技术

研究RNA结合蛋白和其结合的RNA的分子生物学方法，简而言之，就是通过纯化RNA和RNA结合蛋白的复合物。纯化复合物的方法既可以是沉淀RNA，也可以是沉淀RNA结合蛋白。由于沉淀RNA的技术有其局限性，因此科研人员更多的通过沉淀RNA结合蛋白的方法，获得RNA和RNA结合蛋白质的复合物。最初，RNA结合蛋白免疫共沉淀(RIP)技术被科研人员广泛运用到研究RNA和蛋白质的互作领域。

RIP技术首先通过针对靶蛋白的抗体把组织或细胞内的相应的RNA和RNA结合蛋白的复合物沉淀下来。然后经过纯化和分离得到RNA，并通过下游的分析技术得到RNA的信息。RIP技术与ChIP技术的总体思路类似，但是由于研究的对象不同。其相关的步骤有很多变化。而且RNA在体外容易降解，所以对于RNA的操作和实验使用的试剂有更高的要求。RIP技术与microarray技术相结合，就成了RIP-Chip技术；与高通量测序技术相结合就成了RIP-seq技术。RIP技术由于对蛋白和核酸复合物的洗涤比较温和，所以有一定的局限性。在RIP的数据中假阳性的结果比较多，而且也无法得知RNA和蛋白的具体结合位点信息【参见Jayaseelan,S.,F.Doyle,and S.A.Tenenbaum,Profiling post-transcriptionallynetworked mRNA subsets using RIP-Chip and RIP-Seq.Methods,2014.67(1):p.13-9.】。