[发明专利]可共价结合底物的标签蛋白在CLIP中的应用

权利要求书

1.一种使用可共价结合底物的标签蛋白并通过非跑胶非转膜纯化方式进行紫外交联免疫共沉淀获取RNA结合蛋白的靶标RNA的方法，包括如下步骤：

（1）使受体细胞表达融合蛋白，所述融合蛋白是由连接肽将可共价结合底物的Halo标签蛋白和靶蛋白连接而形成的融合蛋白；

所述连接肽为Tev酶的特异性识别序列；

（2）对步骤（1）中表达了所述融合蛋白的受体细胞进行紫外照射，使RNA-蛋白复合物中的RNA与蛋白之间形成共价键而交联，收集细胞样本；

（3）对步骤（2）所收集的细胞样本进行裂解，然后通过连接有所述可共价结合底物的标签蛋白的特异性结合物的介质进行免疫沉淀，获得含有“靶标RNA-融合蛋白-介质”的沉淀样本；所述可共价结合底物的标签蛋白的特异性结合物为含有卤素的配体；

（4）对步骤（3）所得的沉淀样本进行非变性洗涤，然后再进行去磷酸化处理；

所述非变性洗涤为：用含有0.1% Triton X-100和500 mM NaCl的PBS缓冲液洗涤2次；用含有0.1% Triton X-100的PBS缓冲液洗涤3次；其中%表示体积百分含量；

（5）对步骤（4）处理后的样本进行变性洗涤；

所述变性洗涤为两次变性洗涤；

所述两次变性洗涤中的第一次变性洗涤为：用Trizol试剂去除碱性磷酸酶；8M 盐酸胍洗涤2次，每次5分钟；8M尿素洗涤2次，每次5分钟；所述两次变性洗涤中的第二次变性洗涤为：用SDS洗涤液洗涤3次，每次在65℃条件下振荡5分钟；用8M尿素室温洗涤2次，每次5分钟；

所述SDS洗涤液为10% SDS；

（6）对步骤（5）处理后的样本用能够特异性识别所述连接肽的蛋白酶进行酶切处理，从而将由所述靶蛋白和所述靶标RNA形成的RNA-蛋白复合物从所述介质上分离下来；所述“能够特异性识别所述连接肽的蛋白酶”为Tev酶；

（7）将步骤（6）所得的由所述靶蛋白和所述靶标RNA形成的RNA-蛋白复合物中的所述靶蛋白去除，从而获得所述靶标RNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述介质为磁珠。

3.权利要求1或2所述方法在研究蛋白与RNA互作中的应用。

4.一种鉴定RNA结合蛋白的靶标RNA的方法，包括如下步骤：利用权利要求1或2所述方法获得靶标RNA，然后构建cDNA文库，再对所述cDNA文库进行高通量测序，最后根据测序结果进行基因定位。