[发明专利]绒毡层细胞总蛋白提取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物学技术研究领域，尤其是涉及蛋白质分离技术研究领域，是一种从靶细胞中方便、快速、精准分离提取总蛋白质技术范畴。

背景技术

靶向分离高等植物体目的细胞或组织的生物大分子进行其精准分子生物学研究，是目前植物科学领域研究中困扰科学家们的重大难题。而目前生物学研究技术中，进行靶向细胞分离生物大分子技术大多采用石蜡切片辅助激光显微切割及抗原修复方法完成。该技术运用了抗原修复原理，借助专业制片技术与专业细胞组织切割仪以及抗原修复操作技术来达到分离生物组织或细胞的蛋白质及其他生物大分子目的。该技术为上个世纪80年代末由国外发明，之后在医学病理分子生物学中普遍使用。但是由于该技术本身的要求限制了其在生物学领域中广泛推广使用。具体缺陷表现在，一方面石蜡切片技术属于专业的显微制片操作技术，需要训练有素的专业技术人员完成，并且石蜡制片操作流程既冗长又很复杂、繁琐。另一方面目标细胞获取还要经过专业的激光显微切割仪分割操作才能完成。再者，抗原修复操作中使用的加热装置多种多样，如水浴锅、微波炉、高压锅、普通家用锅、消解仪等等，导致了修复结果难以精准控制。因此，目前采用的技术既限制了靶细胞的精准生物学研究的开展，也造成了获得的生物大分子研究结果稳定性的精准控制，如中国专利《一种石蜡包埋组织提取蛋白质的方法》（专利号:200510120873）），《一种从甲醛固定组织或甲醛固定石蜡包埋组织中提取总蛋白方法》（专利号：201010286673.X）等等。

因此，到目前为止尚未有一种方便、简捷的适合靶细胞精准分离生物大分子的完整分离技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于靶细胞精准分离收集总蛋白质的方法。

本发明的技术方案如下：绒毡层细胞总蛋白提取方法，该方法的基本程序包括以下步骤：

1、收集固定绒毡层细胞于研磨器中；

2、加总蛋白提取液快速研磨绒毡层细胞，之后细胞研浆移入离心管，封住离心管的管口；

3、离心管置于金属浴中，于110℃温度，保持30min；然后降至80℃,保持2h，期间20min混匀1次；

4、于4℃，16000×g，15 min，离心分离修复总蛋白溶液；

5、修复总蛋白上清移入新离心管中，加5倍体积蛋白沉淀试剂，-20℃过夜沉淀蛋白；

6、先后加3倍体积不同的蛋白洗涤试剂，轻轻混匀、静置10 min（冰浴中），4℃，16000×g，5 min，洗涤、分离总蛋白；

7、干燥总蛋白。

本发明实施过程中的注意事项：

（1）所述绒毡层细胞收集方法需特别要注意是细胞固定时间长短与蛋白修复与提取至关重要。本发明绒毡层细胞固定最佳时间为3.5-4h。

（2）所述绒毡层细胞固定剂配方为：2%多聚甲醛，10%聚乙二醇、

0.1M磷酸缓冲液，PH7.2（用冰醋酸调节）。

（3）所述总蛋白修复提取液组成成分为：Tris-HCl、SDS、β-巯基乙醇、Borax、TritonX-100、EDTA、Vc、PVPP。适合的浓度范围为：Tris-HCl 65-200mM，SDS 2-4%，β-巯基乙醇5-25%, TritonX-100 1%, Borax40-60mM, EDTA 60-100mM, Vc50mM, PVPP1%,缓冲体系PH2-10，最适合PH8.0。本发明总蛋白修复提取溶液配方为：95或200mMTris-HCl、3.5%SDS、25%β-巯基乙醇、50mMBorax、1%TritonX-100、100mMEDTA、50mMVc、1%PVPP ，PH8.0。

（4）细胞样本与总蛋白修复提取液体积比约1：3-10，优选的1：10。

细胞研磨器具优选为：研磨钵、细胞组织研磨器。

（5）细胞总蛋白修复方法中使用的加热装置优选为：金属浴。

（6）总蛋白高温修复操作为高温热修复和稍高温温育稳定2组不同温度条件组合进行。高温热修复加热温度优选为95-120℃，最佳优选为110℃；高温热修复加热时间优选为20-30min，最佳优选为30min。稍高温热温育温度优选60℃或80℃，最佳优选80℃；稍高温温育稳定时间优选为2h。特别需要注意的是，高温修复和稍高温温育稳定的温度与加热时间对蛋白修复效率甚至修复成败至关重要。高温热修复结束后，蛋白修复液必须要自然降温至室温，否则效果不好或达不到蛋白修复目的，并且样本在高温热修复时，离心管管口务必用耐高热的胶带密封，以达到高温高压目的。