[发明专利]绒毡层细胞总蛋白提取方法

权利要求书

1.绒毡层细胞总蛋白提取方法，其特征在于，该方法包括以下操作步骤：

（1）收集固定绒毡层细胞于研磨器中；

（2）加总蛋白提取液快速研磨绒毡层细胞，之后细胞研浆移入离心管，封住离心管的管口；

（3）离心管置于金属浴中，110℃，保持30min；然后降至80℃,保持2h，期间20min混匀1次；

（4）4℃，16000×g，15 min，离心分离修复总蛋白溶液；

（5）修复总蛋白上清移入新离心管中，加5倍体积蛋白沉淀试剂，-20℃过夜沉淀蛋白；

（6）先后加3倍体积不同的蛋白洗涤试剂，轻轻混匀、静置10 min（冰浴中），4℃，16000×g，5 min，洗涤、分离总蛋白；

（7）干燥总蛋白。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤（1）绒毡层细胞固定收集方法为：剥离花药浸没于固定剂中室温固定3.5-4h,用小棒挤压、敲打将绒毡层细胞与花药其他组织分离，然后再先后经过80目、200目和600目细胞筛过滤出绒毡层细胞，1000×g，室温离心5min，收集绒毡层细胞。绒毡层细胞固定剂为：2%多聚甲醛，10%聚乙二醇、0.1M磷酸缓冲液，PH7.2（用冰醋酸调节PH值）。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤（2）细胞总蛋白修复提取液组成成分为：Tris-HCl、SDS、β-巯基乙醇、Borax、TritonX-100、EDTA、Vc、PVPP；其中各组分浓度范围为：Tris-HCl 65-300mM，SDS 2-4%，β-巯基乙醇5-25%, TritonX-100 1%, Borax40-60mM, EDTA 60-100mM, Vc50mM, PVPP1%, Tris-HCl缓冲液PH8.0。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤（3）细胞总蛋白修复需要使用加热装置，加热装置优选为：金属浴或水浴锅，最佳优选为金属浴。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，总蛋白修复操作为高温修复和稍高温温育稳定2种加热条件组合进行：高温热修复加热温度优选为95-120℃，最佳优选为110℃；高温热修复加热时间优选为20-30min，最佳优选为30min；稍高温温育温度优选60℃或80℃，最佳优选80℃；稍高温温育稳定时间优选为2h。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于：高温修复结束后，蛋白修复液必须采用自然降温方法将蛋白修复液降至室温，否则效果不好或达不到蛋白修复目的。

7.根据权利要求1所述方法，所述步骤（4）修复总蛋白分离与提取方法，其特征在于：修复蛋白溶液离心分离操作优选4℃低温离心，离心力优选为：13000-16000×g，最佳优选16000×g，离心时间优选为15 min。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤（5）所述使用蛋白沉淀法来收集修复总蛋白，蛋白沉淀方法优选为：酚硫酸铵沉淀法、硫酸铵甲醇沉淀法、TCA丙酮沉淀法、纯丙酮沉淀法和丙酮甲醇沉淀法，最佳蛋白沉淀法为硫酸铵甲醇法，还可以为酚硫酸铵和TCA丙酮沉淀法。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤（6）硫酸铵甲醇沉淀法沉淀蛋白后，要先后用冰甲醇和冰丙酮充分洗涤蛋白沉淀，而冰甲醇和冰丙酮用前要于-20℃低温冰冻处理。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤（7）的总蛋白收集方法为干燥法，本发明方法优选真空干燥仪干燥法或室温自然干燥法。