[发明专利]一种基于生物传感器的高通量筛选方法

说明书

本发明公开了一种基于生物传感器的高通量筛选方法，属于高通量筛选技术领域。本发明通过采用液滴包埋含生物传感器细胞方式，对代谢物小分子3‑脱氢莽草酸细胞工厂进行高通量筛选，实现了3‑脱氢莽草酸高产菌株的高效富集，相比生物传感器结合流式细胞仪的单细胞水平筛选方法，本发明一方面利用液滴内细胞可扩增富集特性，将单细胞间荧光信号差异扩大N倍至细胞群体间差异；另一方面，利用液滴隔离单细胞及其分泌产物的特性，排除其他细胞及分泌产物影响，还原细胞与其分泌至胞外代谢物真实交流反馈；通过以上改进有效提高了有益阳性克隆菌株的筛选灵敏性，提高了有益阳性克隆菌株的富集效率。

技术领域

本发明属于高通量筛选领域，涉及一种利用液滴包埋含有生物传感器细胞，实现对产代谢物小分子化合物细胞工厂高通量筛选的方法。

背景技术

近年来，随着代谢工程和合成生物学的不断发展，越来越多高效的微生物细胞工厂得以构建，用以高效合成高附加值代谢物小分子化合物，包括氨基酸、蛋白、有机酸、芳香族化合物等，相比传统化学合成，构建微生物细胞工厂合成代谢物小分子化合物不仅绿色环保，其在降低企业生产成本提高企业竞争力方面发挥着与日俱增的作用，因此以微生物细胞工厂合成高附加值小分子化合物代表了一种发展趋势。

与此同时，作为一种有力的微生物细胞工厂高通量筛选工具，基因编码型生物传感器通过其感应部分感应胞内目标小分子化合物浓度并做出正相关性应答，最终以信号检测平台可检测信号(如荧光信号)呈现出来。因此其可借助包括流式细胞仪、酶标仪等高通量筛选平台对相应细胞工厂突变库进行高通量筛选，以获得目的性状细胞工厂，促进目标代谢小分子化合物微生物细胞工厂改造工程。而且一系列基因型生物传感器已成功应用于相应细胞工厂高通量筛选，提高其代谢小分子化合物合成能力，例如琥珀酸盐，丁醇，氨基酸(如L-酪氨酸，L-亮氨酸，L-精氨酸)和其他高附加值代谢物(如黄酮，内酰胺)。

目前，利用基因型生物传感器进行小分子化合物合成细胞工厂突变库的高通量筛选主要基于流式细胞仪筛选，其特点在于主要检测单细胞胞内荧光信号。尽管生物传感器感应胞内目标小分子化合物以及流式细胞仪检测单细胞内荧光信号均达到相对较高灵敏度，荧光信号背景干扰，荧光信号易引入误差，差异较小细胞单细胞水平不易识别分选等因素却很大程度限制了阳性突变体的筛选效率；另外，包括氨基酸、芳香族化合物等具有重要应用价值的代谢物小分子化合物均属于分泌性小分子化合物，其特征在于小分子化合物在胞内积累量较少，大部分化合物将分泌到胞外。而基于流式细胞仪的单细胞筛选，其细胞均来自于混合细胞的均质环境，即不同细胞合成的小分子化合物分泌到胞外中和形成均质浓度环境，破环了细胞与其自身分泌的代谢小分子化合物真实的交流反馈。以上两方面在一定程度上影响着筛选获得阳性突变体的准确性、灵敏性及有效性。

发明内容

本发明为了解决以上问题，通过采用近年来快速发展的微液滴包埋技术，其通过微液滴将单细胞等包埋形成独立的微反应室，排除其他细胞或物质的干扰，为实时观测细胞代谢以及物质反应提供了更多可能，因此在高通量筛选酶、蛋白、细胞方面发挥着与日俱增的作用。

本发明提供了一种代谢物小分子化合物细胞工厂的高通量筛选方法。

本发明所提供的代谢物小分子化合物细胞工厂的高通量筛选方法，具体可包括如下步骤(I)-(V)：

(I)构建应答代谢物小分子化合物的基因型生物传感器；

(II)构建含有步骤(I)所述基因型生物传感器的产目标代谢物小分子化合物的细胞工厂；

(III)利用诱变技术对步骤(II)所述细胞工厂进行诱变，建立突变库；

(IV)采用微液滴对步骤(III)中所建立的突变库进行单细胞包埋、培养；

(V)对步骤(IV)所述的包含单细胞的微液滴进行高通量筛选。