[发明专利]一种湖北麦冬内生青霉菌属真菌及在制备甾体皂苷中的应用

权利要求书

1.一种利用湖北麦冬内生青霉菌属真菌在制备甾体皂苷中的应用，其特征在于：采用所述的内生青霉菌属真菌菌株通过液体发酵制备得到甾体皂苷；

所述的内生青霉菌属真菌分离自湖北麦冬（Liriope spicata var. proliferaY.T.Ma）的活体块根，经18SrDNA序列鉴定为青霉菌属（Penicillium sp），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2016年12月7日，保藏编号为CCTCC No. M2016724；

所述的青霉菌的制备步骤是：(1)将清洗干净的湖北麦冬块根用75%(V/V)乙醇浸泡2min，用无菌水漂洗；再用有效氯含量4-6%的次氯酸钠溶液浸泡2min，最后用无菌水漂洗、蘸干；

(2)将上述湖北麦冬块根在无菌条件下剪去两头褐变部分，切割成0.5cm×0.5cm组织小片，置于PDA培养基上，每皿植入2片，用parafilm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养；

所述PDA培养基含氨卞青霉素，终浓度为50ug/ml；

(3)5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，最终得到湖北麦冬内生青霉菌真菌；

所述的青霉菌真菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上28℃培养，菌落圆形，最初为白色，渐变为边缘白色，中间褐色，边缘整齐。

2.一种权利要求1所述的湖北麦冬内生青霉菌属真菌在制备甾体皂苷中的应用，其特征在于：采用所述的内生青霉属真菌菌株通过液体发酵制备得到甾体皂苷；所述的液体发酵的培养基是马铃薯液体培养基，所述的液体发酵培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水；

所述的甾体皂苷的制备方法包括以下步骤：

(1)取所述的内生青霉菌属真菌菌株菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm振荡培养72小时，得种子；

(3)将配制好液体发酵培养基分别装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10%的接种量接入种子，28℃下180rpm振荡培养7天；

(4)发酵完毕，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物，研磨粉碎；

(5)将发酵粉碎物转入锥形瓶中，加入100ml 75%乙醇60℃水浴1.5小时后，过滤，得滤液；同时，滤渣再加入100ml的75%乙醇，继续水浴1.5小时后再次过滤，合并2次滤液；

(6)对滤液采用减压浓缩方法，去除乙醇，得到浸膏，加入100ml纯水溶解；

(7)将上述浸膏水溶液转入分液漏斗中，加入40ml乙醚进行充分萃取，去除乙醚层，保留水层；

所述乙醚层含油脂和色素；

(8)将水层溶解物转至新的分液漏斗中，加入100ml水饱和正丁醇进行充分萃取，去除水层，保留正丁醇层，减压浓缩去除正丁醇后，得浸膏，加入甲醇复溶得湖北麦冬甾体皂苷；

所述水层含糖类。