[发明专利]一种微生物发酵制备脱水穿心莲内酯的方法

说明书

本发明公开了一种微生物发酵制备脱水穿心莲内酯的方法，包括如下步骤：步骤S1，菌种培养；步骤S2，微生物转化；步骤S3，转化产物提取；步骤S4，高速逆流纯化；其中，步骤S1中的发酵培养基中添加有有效浓度的离子液体。本发明提供的制备方法可以以常见易培养的短刺小克银汉霉为转化菌株，在发酵培养基中添加特定结构的功能离子液体，将穿心莲内酯转化为脱水穿心莲内酯；同时，若在发酵培养基中添加有效浓度的缬氨酸，可以提高该转化反应的选择性。

技术领域

本发明属于微生物转化领域，具体涉及一种微生物发酵制备脱水穿心莲内酯的方法。

背景技术

穿心莲内酯是穿心莲的主要活性成分之一，具有显著的清热解毒、凉血消肿、抗病毒等作用。现代药理学研究表明，穿心莲内酯的脱水产物—脱水穿心莲内酯及其衍生物具有更好的生物活性，因此对穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及其衍生物的研究引起了人们的极大关注。

由于脱水穿心莲内酯的市场需求量较大，因此寻求适合工业生产的方法非常重要。目前制备脱水穿心莲内酯多采用化学方法(参考文献：Synthsis of andrographolidecyclophosphate derivatives and their antitumor activities.SynthComm,2006,36:407-414)，该方法毒性大、污染严重，且有溶剂残留。李合平等从采集的土壤中分离筛选到一株对穿心莲内酯有较高转化活性的菌种，可以把穿心莲内酯转化为脱水穿心莲内酯，该菌株经美国微生物鉴定和DNA鉴定实验室鉴定为变形斑沙雷菌(参考文献：微生物转化法制备脱水穿心莲内酯，中国药科大学学报，2008，39：479-480)，该方法虽然条件温和且污染较少，但是使用的菌株为新筛选发现的菌株，可获得性和普及性差，不易大规模推广。

申请人研究发现，穿心莲内酯生物转化制备脱水穿心莲内酯时产物较为复杂，至少具有如下两种脱水方式：

但是，脱水产物1才是文献记载的活性高的脱水穿心莲内酯，因此，生物转化法制备脱水穿心莲内酯还需要提高菌种对转化反应的选择性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微生物发酵制备脱水穿心莲内酯的方法，旨在使用常规的菌株以穿心莲内酯为原料进行生物转化制备脱水穿心莲内酯。

本发明由如下技术方案得以实现：

一种脱水穿心莲内酯的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1，菌种培养：

将短刺小克银汉霉菌株接种于新鲜斜面培养基上，25℃恒温培养3d；将菌体从斜面培养基转接至装有液体培养基的三角瓶中，振荡培养2d后成为种子液；吸取种子液转接至装有发酵培养基的三角瓶中，振荡培养2d后成为培养液；

其中，所述液体培养基的配方为：去皮煮沸的土豆泥，200g/L；磷酸二氢钾，3g/L；硫酸镁，0.75g/L；葡萄糖，20g/L；维生素B1，0.15g/L；调节pH值至6.0；

所述发酵培养基为在上述液体培养基中再添加40-60μM季膦离子液体，阳离子结构如下：

其中，n为自然数；

或添加20-40μM苯并三氮唑类离子液体，阳离子结构如下：

其中，n为自然数；

或添加30-50μM咪唑类离子液体，阳离子结构如下：

其中，n为自然数；

步骤S2，微生物转化：

向上述发酵培养液中投入穿心莲内酯0.5-1.5g/L，振荡培养3d进行转化。

步骤S3，转化产物提取：