[发明专利]一种生物样品中有机酸的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物样品有机酸分析领域，具体涉及一种生物样品中有机酸的检测方法。

背景技术

代谢组学是继基因组学、转录组学及蛋白质组学之后得到迅速发展的较新的研究领域，是生物系统中研究低分子量混合物具发展潜力的分析方法，它可以用于分析生物样品中代谢物水平的变化，是对限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分的定性和定量。脂肪酸氧化代谢组学即是分析血液中脂肪酸水平与尿液中有机酸水平。

气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)于1966年由K-Tanaka首先应用于遗传代谢病检测。目前国际上用于尿液预处理的方法主要有两种，即有机酸萃取法和尿素酶法，前者主要应用于欧美国家，使用年限较长，后者是近几年由日本学者建立并在亚洲国家推广的一种相对年轻的方法。尿素酶法是应用滤纸收集尿标本，经尿素酶处理后，不经有机溶剂萃取直接进行GC-MS分析，但未经有机溶剂萃取的气相色谱图的杂峰甚多，不利结果分析，且甚易污染气相色谱柱和质谱离子源。尿液有机酸萃取预处理法对各种特异性代谢产物的检出量高于尿素酶预处理法，且对于后者无法检测到的脂肪二羧酸有机酸经萃取预处理法仍能检测出。在国内，罗小平等（2003年）和孙卫华等（2008年）均采用乙酸乙酯和乙醚直接萃取尿液中有机酸，并以BSTFA-TMCS（99:1）作为衍生剂进行甲基硅烷化衍生；韩风等（2013年）将尿样先采用尿素酶处理，除去尿素及蛋白质，再用乙酸乙酯和乙醚提取尿有机酸，而后用双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷混合物进行甲基硅烷化衍生。

基于质谱技术的不断发展，国内对于有机酸衍生化这块还局限于甲基硅烷化，而甲基硅烷化对反应样品的要求是无水状态，即样品必须要氮气吹干，这对提取的有机酸要求高，同时样品经多次萃取增加了操作的复杂程度，也易造成损失。本发明在原先采用GC测定血液游离脂肪酸的基础上，在一个体系里直接对有机酸/脂肪酸甲脂化后进行萃取，不仅减少了反复萃取可能造成的样品损失，还能很好的满足代谢物有机酸二羧酸类的检测，而国内外尚未见由相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物样品中有机酸的检测方法，其不仅减少了反复萃取造成的样品损失，还可减少有机溶剂的使用量，省去尿素酶及甲基硅烷化剂的使用，大大降低了成本，并可减轻废液对环境的污染。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种生物样品中有机酸的检测方法，其包括以下步骤：

1）将晨尿或空腹血液于2200g离心8min，取上清液分装于冻存管中，于-20℃保存备用；

2）取所得上清液1mL于离心管中，加入100μL内标物十七烷酸，摇匀，再加入100μL质量浓度为2.5%的盐酸羟胺和300μL、10mol/L的氢氧化钠溶液，盖紧，充分混匀后静置1h，再加入130μL质量浓度为50%的硫酸酸化，最后加入2mL质量浓度为10%的硫酸甲醇溶液，漩涡振荡1min后于60℃水浴锅中甲酯化反应90min；

3）反应结束后将其取出，放至室温，然后加入1mL超纯水混匀，再加入2mL氯仿，漩涡振荡2min后于2200g离心8min，得下层溶液；

4）所得下层溶液经0.45μm微孔有机滤膜过滤后置样品瓶中，采用GC-MS进行检测；其色谱条件为：Hp-5ms色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样量：1μL；升温程序：初始40℃保持3min，然后以8℃/min升温至290℃，保持3min；以氦气为载气；流速为1.0mL/min；进样口温度：260℃，传输线：290℃；采用电子轰击离子源质谱检测，其电子能量70 eV；离子源温度230℃；扫描范围：m/z 50-550，扫描方式：全扫描和选择离子扫描，溶剂延迟3.0min。

本发明的显著优点在于：

本发明可实现多种有机酸的同时检测，且其不仅减少了反复萃取造成的样品损失，还可减少有机溶剂的使用量，省去了尿素酶及甲基硅烷化剂的使用，大大降低了成本，并可减轻废液对环境的污染。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

Agilent 7890A/5975C气相色谱-质谱仪，配有电子轰击离子源（EI）及化学工作站（美国Agilent公司）。

一种生物样品中有机酸的检测方法，其包括以下步骤：