[发明专利]一种脐带组织冻存、复苏的方法

说明书

技术领域

本发明属于人体组织冻存复苏技术领域，特别涉及一种脐带组织冻存、复苏的方法。

背景技术

脐带是哺乳类动物连接胎儿和胎盘的管状结构。脐带血中含有丰富的间充质干细胞，间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称为“万用细胞”，适用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的种子细胞。因此，对间充质干细胞进行存储，可以提供重要的医学材料。传统的程序化冻存由于容易使液体产生结晶，往往会对细胞造成机械性损伤；新式的玻璃化冻存可以完全避免结晶问题，从而大大提高冻存细胞的复苏率。但是，玻璃化冻需要使用具有细胞毒性的二甲基亚砜，容易对细胞造成化学性伤害

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种脐带组织冻存、复苏的方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明一方面提供了一种脐带组织冻存、复苏的方法，包括如下步骤：

S1：用生理盐水对新鲜脐带进行清洗，并剪碎成小块，贴壁培养36h～48h，并对得到的细胞进行传代培养6～8d；

将细胞克隆成细胞团后再进行保存，可显著降低单个细胞受损凋亡的概率，从而显著提高细胞的存活率和复苏的成功率；

S2：将步骤S1得到的传代细胞置于DMEM培养基中，于2～5℃下加入预先经超声处理过的冻存保护液，低速离心并轻轻振荡混匀，所述冻存保护液中添加有至少一种细胞粘附分子以及至少一种细胞活性抑制剂；

由于团块结构会显著影响单个细胞与冻存保护液的接触，因此首先通过超声处理、使冻存保护液内部分散成小液滴，从而提高冷冻保护液在细胞团块内的渗透性；

细胞粘附分子是使相邻细胞表面发生作用、从而相互粘附的跨膜蛋白，可以使单个细胞进一步粘合成团块、以防止散失；通过低速离心，促进细胞粘附分子与细胞接触、从而提高细胞相互粘附的概率；离心后需要轻轻振荡混匀，以便冻存保护液与细胞充分接触；

细胞活性抑制剂可以对细胞内的一些生理活动进行可逆的抑制，在不影响细胞活性的前提下提高冻存效果；

S3：将步骤S2得到的细胞混合液置于液氮中，降温至-196℃下保存；

S4：将冻存的细胞取出，立即转移至37℃水浴箱中放置1～2min，取出后用PBS缓冲液洗涤2～4次，离心、弃去洗涤液；

S5：向步骤S4得到细胞中加入预先经超声处理过的复苏保存液，轻轻振荡混匀，得到细胞悬液，所述复苏保存液中添加有至少一种细胞粘附解除分子以及至少一种细胞活性激活剂；

通过超声处理，使复苏保存液内部分散成小液滴，从而提高复苏保存液在细胞团快内的渗透性；

细胞粘合解除分子，可以解除细胞间的相互粘合，有助于细胞相互分离，以便后续的使用；

细胞活性激活剂，可以解除细胞生理活性受到的抑制，从而恢复细胞活性、提高复苏率。

进一步地，所述步骤S1包括如下步骤：

S1.1：取新鲜脐带，用生理盐水清洗干净，采集华通氏胶并剪成1～2mm的碎块，平铺至细胞培养瓶中，加入5mL原代培养基，置于5％CO₂、37℃的培养箱中进行培养，每3～4d更换一次培养基，所述原代培养基为添加有体积分数8～12％的胎牛血清以及100mg/L链霉素的DMEM培养液；

S1.2：当细胞融合度达到80～90％时，收集贴壁细胞，消化后加入5mL传代培养基，置于5％CO₂、37℃的培养箱中进行培养，培养至细胞融合度达到80～90％时为止，所述传代培养基为添加有体积分数12～15％的胎牛血清以及2～5mg/L的柑浓素的DMEM培养基。

柑浓素是从柑橘皮中提取的一种天然混合物，具有极强的抗菌的作用，能抑制细菌等的生长增殖，并且无毒副作用、不会对细胞的生长造成影响，也不会使病原微生物产生抗药性。

进一步地，所述步骤S2包括如下步骤：

S2.1：配置冻存保护液，并在2～10℃、40～100Hz条件下超声振荡5～10min；

S2.2：将步骤S1得到的传代细胞置于8～10％的DMEM培养基中浸泡，超声结束后立即将所述冻存保护液按8～10％的浓度加入所述传代细胞中；

由于超声处理只是暂时改变了液体的物理形态，因此在超声结束后应立即将冻存保护液加入细胞中，以保证冻存保护液的渗透性；