[发明专利]一种脐带组织冻存、复苏的方法

权利要求书

1.一种脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：用生理盐水对新鲜脐带进行清洗，并剪碎成小块，贴壁培养36h～48h，并对得到的细胞进行传代培养6～8d；

S2：将步骤S1得到的传代细胞置于DMEM培养基中，于2～5℃下加入预先经超声处理过的冻存保护液，低速离心并轻轻振荡混匀，所述冻存保护液中添加有至少一种细胞粘附分子以及至少一种细胞活性抑制剂；

S3：将步骤S2得到的细胞混合液置于液氮中，降温至-196℃下保存；

S4：将冻存的细胞取出，立即转移至37℃水浴箱中放置1～2min，取出后用PBS缓冲液洗涤2～4次，离心、弃去洗涤液；

S5：向步骤S4得到细胞中加入预先经超声处理过的复苏保存液，轻轻振荡混匀，得到细胞悬液，所述复苏保存液中添加有至少一种细胞粘附解除分子以及至少一种细胞活性激活剂。

2.如权利要求1所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述步骤S1包括如下步骤：

S1.1：取新鲜脐带，用生理盐水清洗干净，采集华通氏胶并剪成1～2mm的碎块，平铺至细胞培养瓶中，加入5mL原代培养基、置于5％CO₂、37℃的培养箱中进行培养，每3～4d更换一次培养基，所述原代培养基为添加有体积分数8～12％的胎牛血清以及100mg/L链霉素的DMEM培养液；

S1.2：当细胞融合度达到80～90％时，收集贴壁细胞，消化后加入5mL传代培养基，置于5％CO₂、37℃的培养箱中进行培养，培养至细胞融合度达到80～90％时为止，所述传代培养基为添加有体积分数12～15％的胎牛血清以及2～5mg/L的柑浓素的DMEM培养基。

3.如权利要求1所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：

S2.1：配置冻存保护液，并在2～10℃、40～100Hz条件下超声振荡5～10min；

S2.2：将步骤S1得到的传代细胞置于8～10％的DMEM培养基中浸泡，超声结束后立即将所述冻存保护液按8～10％的浓度加入所述传代细胞中；

S2.3：将上述混合体系在1000～1500rpm/min条件下离心5min，离心结束后轻轻振荡混匀1～3分钟，得到细胞混合液。

4.如权利要求3所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述冻存保护液中包含如下重量份数的成分：10～12份渗透性冷冻保护剂、6～8份非渗透性冷冻保护剂、0.05～0.1份细胞活性抑制剂以及0.1～0.2份细胞粘附分子；

所述渗透性冷冻保护剂包括重量份数比为1:2:1～3的二甲基亚砜、甘油以及聚乙二醇；

所述非渗透性冷冻保护剂包括重量份数比为1:1～2的海藻糖以及聚蔗糖；

所述细胞活性抑制剂包括细胞松弛素D、诺考达唑、衣霉素、几夫碱、布雷非德菌素A、CP-10447以及奥曲肽中的至少一种；所述细胞粘附分子包括E-选择素、P-钙黏素、ICAM-1、肽F9以及RGD肽中的至少一种。

5.如权利要求4所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述细胞活性抑制剂包括重量份数比为1:1:1的细胞松弛素D、衣霉素以及奥曲肽。

6.如权利要求4所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述细胞粘附分子包括重量份数比为1:1的E-选择素和ICAM-1。

7.如权利要求1所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述步骤S5包括如下步骤：

S5.1：配置复苏保存液，并在2～10℃、40～100Hz条件下超声振荡5～10min；

S5.2：超声结束后，立即将所述复苏保存液按8～10％的浓度加入步骤S4得到的细胞中，轻轻振荡混匀1～3分钟，得到细胞悬液。

8.如权利要求7所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述复苏保存液包括如下重量份数的成分：

15～20份植物源重组人血清白蛋白、0.5～2份γ-球蛋白、0.8～1份氯化钠、0.8～1.2份糖类、0.05～0.1份细胞活性激活剂以及0.1～0.2份细胞粘附解除分子。