[发明专利]一种检测外周血TCR可变区编码基因的液体活检试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了可用于预测乳腺癌患者对治疗药物的敏感性的基因标志物，该基因标志物是TRBV15。本发明实验证明乳腺癌患者外周血T细胞中TRBV15基因频率和基因表达在疗效pCR组和non‑pCR组之间存在差异，根据差异可以区分能从曲妥珠单抗联合化疗新辅助治疗中生存获益的乳腺癌人群。本发明还公开了预测乳腺癌患者对治疗药物的敏感性的产品，该产品可以通过检测血液中TRBV15基因频率或基因表达来实现预测目的。

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断、治疗领域，更具体地，本发明涉及以检测TRBV15异常为手段的预测患者对肿瘤治疗药物的敏感性的方法和用途。

背景技术

乳腺癌是目前女性最常见的恶性肿瘤，GLOBOCAN2012资料显示2012年全球共有170万乳腺癌新增病例，总死亡52.2万例，居女性癌症死因的第二位，因此其疗效预测及改善预后一直是临床科研工作者的研究重点。在局部晚期或高生物学风险的乳腺癌患者中，新辅助治疗用于缩小肿瘤负荷以增加根治性切除率及保乳率并减少疾病复发和死亡的风险。激素受体(HR)(即雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR))阴性表达和HER2过表达是与乳腺癌疾病进展和预后差相关的分子生物学因素。大约20-30％的乳腺癌患者HER2过表达。HER2阳性乳腺癌患者的预后因曲妥珠单抗的应用有了很大的改善。关于新辅助治疗疗效，研究证实疗效达病理完全缓解(pCR)患者无病生存期和总生存期的延长具有显著相关性，预后明显优于非pCR患者。在当前的实践中，有大肿瘤负荷的HR阴性HER2阳性的乳腺癌患者通常受益于曲妥珠单抗联合化疗的新辅助治疗，有近30-50％的患者疗效能够达到pCR。

目前仍缺乏有效预测pCR的分子标志物，预测治疗反应是具有挑战性和亟待解决的临床难题。当肿瘤发生后，机体可产生针对肿瘤抗原的适应性免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫，其中细胞免疫占主要地位，体液免疫仅在少数情况下起协同作用。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)是存在于肿瘤癌巢内及间质中的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体。近年来，随着肿瘤免疫学的进展，TIL成为乳腺癌研究者关注的焦点，并有较多最新研究结果证实了其在新辅助治疗和辅助治疗疗效和预后预测方面的价值。不同乳腺癌分子分型中，三阴性与HER2阳性乳腺癌病灶中TIL浸润程度较高；这可能与这两种分子分型的乳腺癌细胞具有较强的免疫原性，从而可较大程度地激活机体的免疫反应有关。有研究显示在HER2阳性肿瘤患者人群中，新辅助治疗后TIL水平提高也与更高的pCR率相关。曲妥珠单抗可以通过刺激HER2特异性的毒性T细胞来引发特异性的适应性免疫反应。之前的一项研究表明，曲妥珠单抗新辅助治疗的乳腺癌患者中，针对HER2的T细胞应答与pCR显著相关。

以前的大多数研究简单地量化肿瘤组织中T淋巴细胞的数量，但T淋巴细胞是一群极具异质性的免疫细胞群，T细胞受体(TCR)的也存在分子多样性。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，分为两类：TCR1和TCR2；TCR1由γ和δ两条肽链组成，TCR2由α和β两条肽链组成。外周血中，90％-95％的T细胞表达TCR2。TCR的每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等几部分，其抗原特异性存在于V区；V区又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，最能代表受体库的特异性。TCR是由V、D、J、C四个基因簇编码的，其中V区(可变区)是由V、D、J基因簇通过V-J(TCRα)和V-D-J(TCRβ)片段间的基因重排、剪接等过程编码。在重排时，β链在胚系DNA水平上先进行D-J的重排，而后V与DJ重排连接；β链VDJ基因重排完成后发生α链VJ基因重排。各个基因片段之间的连接处会随机插入丢失一些寡核苷酸片段，在T淋巴细胞的亲和力成熟阶段还会发生高频突变，在这些机制的介导下，产生了数量巨大的TCR库。因此，TCR DNA测序是一个有吸引力和潜力的替代TIL，探索肿瘤抗原特异性T细胞表面特征，并分析TCR基因多态性与治疗敏感性的相关性。在本研究中，申请人通过对新辅助治疗前外周血T细胞中TCRβ链CDR3区域进行高通量二代测序研究了TCRB的基因多态性。本申请的目标是通过对外周血T细胞中TCRβ链CDR3区基因进行高通量二代测序，以期待发现可以预测HER2阳性早期乳腺癌新辅助治疗疗效达pCR的分子标志物。