[发明专利]基于万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒和纳米标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物与生化光谱分析领域，涉及一种表面增强拉曼散射检测中细菌的通用方法，具体涉及一种用于细菌捕获、检测的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的制备及其与金核银壳纳米颗粒联用协同增强细菌拉曼信号的检测方法。

背景技术

病原菌一直以来都是人类健康的重大威胁。越早的实现细菌感染的准确诊断，患者的存活率越高。因此，准确、快速、高灵敏的鉴别、检测致病菌是防治细菌感染的关键。目前，临床医生常用的检测方法主要是传统的细菌分离培养法，但该方法耗时长，操作繁琐。新兴的一些基于分子检测的方法如核酸测序、酶联免疫吸附测定或者聚合酶链式反应等需要昂贵的仪器、成本高、检测目标单一。

表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering，以下简称SERS)是一种具有强大的振动光谱技术，可以对金、银等贵金属表面的物质进行无损和超灵敏检测，目前已被证明可用于细菌的指纹谱鉴定(参见Biosensors and Bioelectronics 94(2017)131–140)。SERS在检测细菌方面具有灵敏度高、快速、无损、无需样品处理等优点，但主要缺点是抗干扰能力较差，容易受到实际样品中杂质的干扰。为了解决这一问题，研究人员开始使用生物识别分子修饰的SERS基底从溶液中捕获出细菌后再进行检测。万古霉素被证明是一种有效、广谱的细菌识别分子，可与细菌细胞壁作用形成牢固的氢键，既可以作用于革兰阳性菌也可以捕获革兰阴性菌。如2011年中国台湾地区科学家王玉麟教授将万古霉素修饰在商业化的SERS固体基底上实现了血液中细菌的捕获检测(参见Nature Communications.2011；2:538)。但目前报道的方法中，万古霉素都修饰在制备方法复杂的固态SERS基底上。固态SERS基底在溶液中捕获细菌的效率较低，而且价格昂贵，不适合广泛使用。液态磁性SERS基底以磁珠为核心，表面包覆一层金/银壳的SERS增强材料，特别适用于溶液中目标物质的捕获、富集与增强。目前，现有技术中尚无关于利用万古霉素修饰的磁性SERS基底快速检测尿液环境中细菌指纹谱的详细报道。

目前基于SERS检测病原菌的方法可以分为直接获取细菌的拉曼指纹信号(label-free) 和通过拉曼标签(tags)标记后间接检测细菌两大类(参见Analyst,2013.138(10):p.3005-12)。前一种方法利用SERS直接获得细菌的分子特征谱图并进行分析检测。而标记法是将细菌与一个具有很强拉曼信号的标签通过免疫或杂交等方法相连，并通过间接检测标签的信号来实现生物传感的方法(参见Chem Rev,2013.113(3):p.1391-428)。SERS标签指的是可提供良好SERS信号并易于修饰到目标物上的一些材料。这种SERS标签常以纳米级的金银颗粒作为增强基底，表面修饰上提供SERS信号的染料分子，以及可以跟菌体结合的生物识别分子 (抗体、适配体等)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的制备方法，以及一种纳米金标签材料的制备方法，并基于这两种材料的联用实现尿液中细菌的快速捕获及SERS检测。本发明利用万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒快速捕获尿液中的细菌，清洗除去杂质后，再向用磁富集的金壳磁性纳米颗粒/细菌复合物中加入纳米金标签材料，后者的适配体可特异性识别细菌，且材料中的拉曼分子可表达拉曼信号。万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒既作为高效捕获细菌的工具，又作为表面增强拉曼光谱基底材料。细菌的SERS信号不是直接来源于细菌，而是来源于纳米金标签材料标记的拉曼信号分子。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：利用11-巯基十一烷酸对制备的金壳磁性纳米颗粒进行羧基化，并作为连接臂用于万古霉素的高效偶联。万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒既作为细菌快速捕获的工具，又可以联合滴加的适配体修饰的纳米金材料，可特异性识别细菌并发出拉曼信号，实现细菌的快速、高效SERS检测。

本发明第一方面提供一种万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒，是以粒径100-1000纳米磁性纳米颗粒为核心，在表面修饰PEI(即聚乙烯亚胺)后吸附一层密集均一的金种子，并利用盐酸羟胺还原作用使得吸附的金种子生长至连续的金壳，再以此金壳磁性纳米颗粒 (Fe₃O₄@Au)为核心通过氨基化反应表面修饰11-巯基十一烷酸(MUA)作为连接臂，然后通过酰胺反应高效偶联上一层万古霉素。