[发明专利]一种用于扩增人间充质干细胞的培养基及其扩增方法

说明书

技术领域

本发明属于间充质干细胞的培养技术领域，具体涉及一种用于扩增人间充质干细胞的培养基及其扩增方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为胰岛、神经、血管内皮、骨、软骨、肌肉、肝脏、心肌等多种组织细胞。MSCs因其相对缺少免疫源性，培养技术简单，并可冷冻保存，因此，已成为细胞及基因治疗研究的种子细胞，具有潜在的临床应用价值，已成为干细胞研究的热点。

目前，用于间充质干细胞的培养和扩增的培养基主要是在基础培养基的基本上添加一定浓度的动物血清如胎牛血清(FBS)，动物血清含有异种蛋白质，使用动物血清培养和扩增的自体间充质干细胞在临床治疗时，可致受者体内产生抗体，从而引起免疫反应。因此，不含血清的培养基成为人们研究的热点。但目前可见的间充质干细胞无血清培养技术普遍存在着培养成本高，扩增数量有限，扩增时间长，干细胞易分化等不足，直接影响临床应用的安全性。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种用于扩增人间充质干细胞的培养基及其扩增方法，可有效解决现有的扩增培养基扩增速度慢，扩增时间长，干细胞易分化等问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于扩增人间充质干细胞的培养基，包括基础培养基和添加于培养基中的添加剂，该添加剂包括以下终浓度的组分：亚油酸2-10μL/mL、人源AB型血清5-15μL/mL、人转铁蛋白5-15μg/mL、L-谷氨酰胺1.5-3mmol/mL、维生素C2-5mg/mL、葡萄籽提取物0.5-1mg/mL、红景天苷1-5mg/mL、人参皂苷5-10mg/mL、枸杞多糖2-5mg/mL、东当归酞内酯0.2-0.6mg/mL、血小板衍生生长因子0.1-0.2μL/mL和表皮细胞生长因子0.1-0.2μL/mL。

进一步地，一种用于扩增人间充质干细胞的培养基，包括基础培养基和添加于培养基中的添加剂，该添加剂包括以下终浓度的组分：亚油酸8μL/mL、人源AB型血清10μL/mL、人转铁蛋白10μg/mL、L-谷氨酰胺2.2mmol/mL、维生素C 3mg/mL、葡萄籽提取物0.8mg/mL、红景天苷3mg/mL、人参皂苷6mg/mL、枸杞多糖3mg/mL、东当归酞内酯0.3mg/mL、血小板衍生生长因子0.1μL/mL和表皮细胞生长因子0.2μL/mL。

进一步地，红景天苷通过以下方法制备得到：将红景天与水以固液比为1-2：20-30混合，常温浸泡0.5-1h，然后煎煮0.5-1h，过滤，再向药渣中加入药渣6-8倍重量的水，继续煎煮0.5-1h，过滤，合并两次滤液，然后浓缩至相对密度为1.1-1.2，最后加乙醇使含醇量的体积百分比为70-75％，搅拌，静置，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1-1.2，然后干燥并除去乙醇，制得。

进一步地，基础培养基为DMEM/F12培养基。

采用上述培养基对间充质干细胞进行扩增的扩增方法，包括以下步骤：

(1)人间充质干细胞原代分离培养

从脐带或胎盘分离出人间充质干细胞，或从骨髓血、脐带血或胎盘血中分离出单个核细胞，置于上述培养基中进行分离纯化培养；

(2)扩增培养

将步骤(1)分离纯化培养后的细胞再置于新鲜的上述培养基中进行传代培养。

进一步地，步骤(1)具体过程如下：

①在无菌条件下，将脐带或胎盘用PBS缓冲液清洗2-3次后，切碎，获得组织碎块，然后将组织碎块加入含有0.05％胰酶和2mg/mLⅣ型胶原酶的酶液中，置于37℃消化过夜，过夜期间每隔3-5h混匀一次；

②去除步骤①中上清液，向消化后的组织中加入胰酶，置于37℃消化5-10min，然后加入培养基终止消化，最后离心，弃上清；

③将步骤②所得沉淀加入培养基中，37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔3-4天换一次培养基，待细胞融合度为70-80％时，用消化液消化细胞，然后离心，收集细胞。

进一步地，0.05％胰酶和2mg/mLⅣ型胶原酶的体积比为1：2-4。

进一步地，步骤(1)具体过程如下：