[发明专利]一种用于扩增人间充质干细胞的培养基及其扩增方法

权利要求书

1.一种用于扩增人间充质干细胞的培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加于培养基中的添加剂，所述添加剂包括以下终浓度的组分：亚油酸2-10μL/mL、人源AB型血清5-15μL/mL、人转铁蛋白5-15μg/mL、L-谷氨酰胺1.5-3mmol/mL、维生素C 2-5mg/mL、葡萄籽提取物0.5-1mg/mL、红景天苷1-5mg/mL、人参皂苷5-10mg/mL、枸杞多糖2-5mg/mL、东当归酞内酯0.2-0.6mg/mL、血小板衍生生长因子0.1-0.2μL/mL和表皮细胞生长因子0.1-0.2μL/mL。

2.根据权利要求1所述的用于扩增人间充质干细胞的培养基，其特征在于，所述添加剂包括以下终浓度的组分：亚油酸8μL/mL、人源AB型血清10μL/mL、人转铁蛋白10μg/mL、L-谷氨酰胺2.2mmol/mL、维生素C 3mg/mL、葡萄籽提取物0.8mg/mL、红景天苷3mg/mL、人参皂苷6mg/mL、枸杞多糖3mg/mL、东当归酞内酯0.3mg/mL、血小板衍生生长因子0.1μL/mL和表皮细胞生长因子0.2μL/mL。

3.根据权利要求1或2所述的用于扩增人间充质干细胞的培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

4.根据权利要求1或2所述的用于扩增人间充质干细胞的培养基，其特征在于，所述红景天苷通过以下方法制备得到：将红景天与水以固液比为1-2：20-30混合，常温浸泡0.5-1h，然后煎煮0.5-1h，过滤，再向药渣中加入药渣6-8倍重量的水，继续煎煮0.5-1h，过滤，合并两次滤液，然后浓缩至相对密度为1.1-1.2，最后加乙醇使含醇量的体积百分比为70-75％，搅拌，静置，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1-1.2，然后干燥并除去乙醇，制得。

5.采用权利要求1-4任一项所述的培养基对人间充质干细胞进行扩增的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)人间充质干细胞原代分离培养

从脐带或胎盘分离出人间充质干细胞，或从骨髓血、脐带血或胎盘血中分离出单个核细胞，置于培养基中进行分离纯化培养；

(2)扩增培养

将步骤(1)分离纯化培养后的细胞再置于新鲜的培养基中进行传代培养。

6.根据权利要求5所述的人间充质干细胞的扩增方法，其特征在于，步骤(1)具体过程如下：

①在无菌条件下，将脐带或胎盘用PBS缓冲液清洗2-3次后，切碎，获得组织碎块，然后将组织碎块加入含有0.05％胰酶和2mg/mLⅣ型胶原酶的酶液中，置于37℃消化过夜，过夜期间每隔3-5h混匀一次；

②去除步骤①中上清液，向消化后的组织中加入胰酶，置于37℃消化5-10min，然后加入培养基终止消化，最后离心，弃上清；

③将步骤②所得沉淀加入培养基中，37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔3-4天换一次培养基，待细胞融合度为70-80％时，用消化液消化细胞，然后离心，收集细胞。

7.根据权利要求6所述的人间充质干细胞的扩增方法，其特征在于，0.05％胰酶和2mg/mLⅣ型胶原酶的体积比为1：2-4。

8.根据权利要求5所述的人间充质干细胞的扩增方法，其特征在于，步骤(1)具体过程如下：

采集人骨髓血、脐带血或胎盘血，利用淋巴细胞分离液分离并收集单个核细胞，然后将核细胞置于培养基中，调整细胞浓度为1-3×10⁶个/mL，然后置于37℃、5％CO₂条件下孵育24h后收集贴壁细胞，制得分离纯化的间充质干细胞。