[发明专利]促进基因编辑T细胞活化及扩增的生物膜、制法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其是生物工程技术领域，具体涉及一种含有修饰CD137L蛋白的生物膜的制备方法并包括该重组生物膜在激活基因编辑T淋巴细胞并促进基因编辑T淋巴细胞增殖方面的应用。用该重组生物膜培养的基因编辑T淋巴细胞可以应用于临床细胞免疫治疗，也可用于基础医学研究、临床应用研究及生物技术研究，尤其可用于免疫系统研究和肿瘤杀伤作用研究。

背景技术

T淋巴细胞是人体最重要的免疫细胞之一，由胸腺内的淋巴干细胞分化而来，成熟后迁移到外周血；按其功能可分为三个亚群：辅助性T细胞、抑制性T细胞和细胞毒性T细胞。T淋巴细胞的正常功能对于维护机体的健康及其重要，它们的缺陷和功能异常可导致包括自身免疫性疾病和肿瘤等在内的各种疾病。目前，免疫学研究包括各种对T淋巴细胞的基础和临床应用的研究日益深入且发展迅速，在人T细胞来源和数量受限的现实情况下，对T细胞的需求日益迫切。因此，有必要建立一个有效，方便的体外T细胞活化和增殖方法来获取大量具功能活性的T细胞以满足需求。T细胞的激活需要两个信号的参与：一个是TCR接受抗原递呈细胞(APC)传导的MHC-抗原肽信号，另一个是细胞膜表面黏附分子提供的协同刺激信号(或称第二信号)。增强T淋巴细胞活化所需要的协同刺激信号是增强抗肿瘤免疫的重要方法。CD137是继CD28/B7之外新发现的另一重要的T细胞协同刺激分子，CD137与CD137配体(CD137L)在维持T细胞，尤其是T细胞的活化、增殖的方面具有重要的意义。

CD137(亦命名为4-1BB)是近年发现的TNFR家族的新成员，在调节细胞增殖、分化、凋亡中起重要作用。CD137是I型跨膜糖蛋白，由信号肽、胞外区、疏水区及胞内区构成，以单体或二聚体形式表达于活化的T细胞表面。它不仅表达于活化的T淋巴细胞、NK细胞、 NKT细胞、CD4/CD25调节T细胞，也可表达于活化的胸腺细胞和上皮内淋巴细胞。此外，CD137还可表达于一些非淋巴细胞，如单核细胞、粒细胞及树突状细胞(DC)等，提示CD137可能在免疫调节中起重要作用。其配体CD137L(亦命名为4-1BBL)首先由Goodwin 等利用表达筛选法在小鼠胸腺瘤细胞中分离出，随后又在人CD4+T 细胞克隆中分离得到。CD137L也是TNFR家族的成员，是存在于细胞表面的II型膜蛋白，与其他TNF家族有相似的C-端氨基酸，分子量为34KD。其膜型也是一种可诱导的细胞表面抗原，可表达于多种抗原呈递细胞(APC)、各种肿瘤细胞及活化诱导的T细胞上。人和小鼠的CD137L氨基酸序列有36％的同源性。CD137分子对T细胞活化的重要作用已得到充分认可。在鼠和人T细胞中均可观察到，仅有亚适量CD3抗体(第一信号)的存在下，CD137便可诱导T细胞增值和细胞因子的合成(主要是IFN-α)，以及抑制活化细胞的死亡。协同刺激信号可通过提高抗原特异性和效应CD8+T细胞的数量来增强效应功能(例如，干扰素的释放，细胞毒作用)。但在缺乏CD3抗体信号时，CD137分子的刺激并不能改变T细胞的功能，表明CD137只是一种协同共刺激分子。

细胞膜又称细胞质膜或者生物膜，是细胞对外界的屏障，它使细胞与周围环境相隔离，并保持着稳定的细胞构型及胞内外的环境。细胞膜表面蛋白是细胞膜的重要组成部分，它们参与了细胞的免疫应答、信号传导、物质及能量的传递等重要功能，对细胞的生存、生长、分裂和分化都至关重要。

发明内容

针对修饰CD137L对T细胞的扩增的刺激作用，以及现有技术在 T细胞体外扩增中的不足及实际的需求，本发明提供了一种含有修饰 CD137L的重组细胞膜蛋白的制备方法及应用，本发明提供了该重组生物膜的制备方法以及该重组生物膜在基因编辑T细胞活化及扩增中的应用。

本发明提供了一种促进基因编辑T细胞活化及扩增的重组生物膜制备方法，该重组生物膜通过如下步骤制备：

1)将修饰的CD137L基因序列通过基因重组方法导入到K562细胞基因组上，获得在K562细胞表面稳定表达修饰CD137L蛋白的的稳转株细胞，命名为rCD137L-K562细胞。所述rCD137L的含义即为前述的“修饰的CD137L”

2)对步骤1)所述的rCD137L-K562细胞进行常规培养，通过细胞裂解液将细胞破碎，然后通过差速离心法获得含有修饰CD137L蛋白的生物膜，再使用亲和层析或亲和磁珠分离的方法将含有修饰 CD137L蛋白的生物膜片段进行富集、纯化。