[发明专利]促进基因编辑T细胞活化及扩增的生物膜、制法及应用

权利要求书

1.一种促进基因编辑T细胞活化及扩增的重组生物膜制备方法，其特征在于，该重组生物膜通过如下步骤制备：

1)将修饰的CD137L基因序列通过基因重组方法导入到K562细胞基因组上，获得在K562细胞表面稳定表达修饰CD137L蛋白的的稳转株细胞，命名为rCD137L-K562细胞；

2)对步骤1)所述的rCD137L-K562细胞进行常规培养，通过细胞裂解液将细胞破碎，然后通过差速离心法获得含有修饰CD137L蛋白的生物膜，再使用亲和层析或亲和磁珠分离的方法将含有修饰CD137L蛋白的生物膜片段进行富集提取、纯化；

所述修饰的CD137L基因为NM_003811中第39位至第803位基因表示的CD137L的全基因序列和在CD137L基因终止密码子(第801位至第803位)前加入蛋白标签序列后所得的基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白标签序列为6个His蛋白基因序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的基因重组方法包括ZEN，TALENs、CRISPR-CAS9基因编辑方法中的一种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因重组方法为CRISPR-CAS9基因编辑方法。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富集提取、纯化的方法为：

1)向所述rCD137L-K562细胞中加入细胞裂解液，将裂解液置于冰上30分钟，细胞裂解液包含终浓度250mM的蔗糖、pH7.5且终浓度20MM的HEPES、终浓度10mM的KCl、终浓度1.5mM的EDTA、终浓度1mM的EGTA、质量体积比0.5％的蛋白酶抑制剂；

2)4℃条件下，1000G离心10分钟，取上清；

3)4℃条件下，16000G离心10分钟，取上清；

4)4℃条件下，100000G离心60分钟，取上清；

5)将上述经差速离心获得的细胞上清，用0.45um滤膜过滤；采用表面富含His抗体的磁珠纯化含有rCD137L的重组细胞膜，分别用含20mM、50mM、100mM和400mM咪唑浓度的缓冲液进行阶段洗脱，得到含有rCD137L膜蛋白的生物膜。

6.如权利要求1～5任一项所述方法制备得到的生物膜。

7.权利要求6所述的生物膜在促进基因编辑T细胞活化及扩增方面的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：将所述生物膜与体外培养的基因编辑T淋巴细胞接触。