[发明专利]外泌体蛋白CD5L的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，具体地，涉及一种外泌体蛋白CD5L的检测方法。

背景技术

外泌体，是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约40-100nm。最近几年，人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。常常用于鉴定外泌体的经典的Marker有CD9，CD81，CD63，HSP70，TSG101等。这些发现点燃了人们对细胞分泌膜泡的兴趣。最近的研究发现外泌体在很多生理病理机制中起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。

随着外泌体特异性蛋白研究的逐渐兴起，许多新型蛋白被发现，血清外泌体膜表面除含有CD9，CD63和CD81标志蛋白外，还含有新型的特定标记蛋白，如黑色素瘤患者体内血清外泌体中特定表达caveolin-1蛋白，人体血细胞产生的外泌体上的特异性蛋白CD34+，尿液外泌体上特异性的蛋白CD24等。

目前，血清外泌体的分离主要有基于超速离心的分离技术，基于分子大小的分离技术(色谱法)，PEG沉淀法，基于免疫吸附的分离技术等。离心法对外泌体得率较高，但其耗时耗力，不适合大量样本操作。色谱法提取的外泌体纯度较高，但其分离易受杂蛋白干扰,操作稳定性差。大分子聚合物沉淀外泌体耗时短，所得外泌体纯度低，并且不能高通量的比较不同样本中外泌体的含量。

因此开发出高灵敏度、高选择性、价钱低廉、直接测定血清中外泌体的CD5L的方法引起了人们的研究兴趣。

发明内容

本发明的目的是提供一种外泌体蛋白CD5L的检测方法，优点是所需样本量小，同时检测所用设备成本低、小型化，可高通量、特异性地检测含有CD5L蛋白的特定外泌体含量，对外泌体的临床检测应用具有重要意义。

本发明的基本思想是使用酶联免疫吸附的方法定量检测血清外泌体中所含CD5L的量。

本发明提供了一种外泌体蛋白CD5L的检测方法，该方法包括以下步骤：

1)预处理，取新鲜血清，经离心，初步去除杂质，取上清，进行超声破碎；

2)于固相载体(例如96孔酶标板)上包被单克隆抗体CD5L；

3)向步骤2)所得固相载体上(例如96孔酶标板)加入封闭液进行封闭；

4)向步骤3)封闭之后的固相载体(例如96孔酶标板)中加入步骤1)预处理的血清，孵育；

5)向步骤4)封闭之后的固相载体(例如96孔酶标板)中加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育；

6)在步骤5)中得到的产物在加入TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)显色液，显色，检测OD值(如用酶标仪)。

进一步地，步骤1)包括室温下取新鲜血清，与室温条件下离心，3000g，30分钟；初步去除杂质，取上清；将上清与含1％脱脂奶的PBS按照体积比1∶29进行稀释，然后进行超声破碎。

进一步地，所述超声破碎条件为5s on(开)，5s off(关)，即间隔5s开关一次，至少60cycles(循环)，low frequncy(低频)。

进一步地，步骤2)中固相载体上所述包被蛋白即包被单克隆抗体CD5L的含量为200ng/孔；包被温度为4℃，包被时间为12小时，包被稀释液为碳酸盐缓冲液。

进一步地，步骤3)所述固相载体(例如96孔酶标板)需要经过PBST(10％tween 20溶于PBS)洗涤至少5遍；步骤3)所述封闭液为含5％脱脂奶的PBS，封闭时间为2小时。

进一步地，步骤4)所述固相载体(例如96孔酶标板)需要经过PBST(10％tween 20溶于PBS)洗涤至少3遍；步骤4)所述预处理的血清添加量与包被单克隆抗体CD5L的质量比为(70～100ug):200ng；孵育时间优选为3.5小时。

进一步地，步骤5)所述辣根过氧化物酶标记的二抗用含1％脱脂奶的PBS按照1∶3500的比例稀释，孵育时间优选为1.5小时。

进一步地，步骤6)中加入的TMB显色液与所述包被单克隆抗体CD5L的体积质量比为100ul:200ng；37℃，孵育至少10分钟，加入50mM H₂SO₄终止反应，于450nm处检测OD值。

若无特殊指明，本发明所述TMB显色液购自美国Amresco公司。

本发明的技术特点在于：