[发明专利]小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取以及活性测定

说明书

本发明公开了小球藻邻苯二酚1,2‑双加氧酶的提取以及活性测定，提取的具体步骤为：将小球藻粉低温研磨，加入Tris‑HCl缓冲液，离心得胞内酶粗酶液；将粗酶液滤，浓缩，透析，上样到纤维素柱，洗脱，浓缩，透析，浓缩，上样到Mono‑Q柱，洗脱，透析，浓缩，干燥，即得邻苯二酚1,2‑双加氧酶。小球藻邻苯二酚1,2‑双加氧酶的酶活性测定方法为：将反应体系在水浴中反应，测定产物的生成量。有益效果为：本发明的提取邻苯二酚1,2‑双加氧酶的方法除杂率高、条件温和、纯度高，能较好地保持酶的活性，并能维持酶之间的相互作用，具有较大发展潜力；该酶的活性测定简单可行。

技术领域

本发明涉及邻苯二酚1,2-双加氧酶，尤其是涉及小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取以及活性测定。

背景技术

邻苯二酚（C₆H₆O₂）又名儿茶酚，是苯的两个邻位氢被羟基取代后形成的化合物，一般以衍生物的形式广泛存在于自然界中，是芳香类物质降解的重要中间产物。邻苯二酚及其衍生物是一类重要的化工产品，可广泛应用在医药、农药、食品、香料、化学助剂等方面。由于邻苯二酚能在各行业中广泛应用，邻苯二酚的需求量随着经济的快速发展也与日俱增，各类废水的排放量及复杂度也随着增大。而邻苯二酚属于高毒性物质，少量邻苯二酚经皮肤吸收就会引起湿疹性皮炎，邻苯二酚可经皮肤、呼吸道和消化道进入生物体，含有邻苯二酚的废水都具有致癌、致崎、致突变等潜在危害。所以，工业中邻苯二酚释放到土壤和水体中，通过富集作用，不仅污染环境，还会对人类的生存发展构成威胁，具有类激素作用，导致内分泌紊乱而危害生物健康。且随着生产和使用量的增加，进入环境中的邻苯二酚也相应增加，环境中邻苯二酚的污染危害日渐严重，因此，环境中邻苯二酚的有效去除已引起人们的广泛关注。

目前，在生物降解处理邻苯二酚中的最主要的途径之一，即为：在邻位开环代谢途径（ortho-pathway）中，邻苯二酚1,2-双加氧酶催化裂解邻苯二酚，形成顺,顺-粘糠酸中间物，该中间产物在后随相应酶的逐级降解作用下，被降解为琥珀酸和乙酰辅酶A。因此，如何制备高纯度的邻苯二酚1,2-双加氧酶是有效治理水污染的手段之一。

发明内容

本发明的目的在于提供小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取以及活性测定，该提取方法除杂率高、条件温和、能较好地保持酶的活性，所提取的邻苯二酚1,2-双加氧酶的纯度高，此外，酶的活性测定简单可行。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取，包括胞内酶粗酶液制备、浓缩透析、首次纯化、二次纯化，提取的具体步骤为：

胞内酶粗酶液制备：将对数期后期小球藻液抽滤，烘干得小球藻粉，然后在2-5℃下研磨5-15min，再加入pH为7.8-8.2的Tris-HCl缓冲液，小球藻粉与Tris-HCl缓冲液的重量体积比为1:1.8-2.3，混合均匀后在温度为2-5℃、转速为8000-12000r/min的条件下离心10-20min，上清液即为胞内酶粗酶液，该步骤在低温状态下研磨小球藻粉，可快速破碎细胞壁，使小球藻细胞内的酶能快速释放出来，可操作性强，同时该步骤中缓冲液对酶的溶解度高，够防止pH值的剧烈波动，保护胞内邻苯二酚1,2-双加氧酶的生物活性不受损害，有利于邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取，可有效抑制酶的降解，并能维持酶之间的相互作用；

浓缩透析：将胞内酶粗酶液经0.15-0.3μm微孔滤膜过滤，再用聚乙二醇PEG 20000浓缩，并用浓度为9-11mmol/L、pH为6.8-7.2的磷酸盐缓冲液透析12-18h，即得邻苯二酚1,2-双加氧酶的粗品，该步骤微孔滤膜可过滤去除多余菌体，减少酶粗品中的杂质，浓缩时吸收剂只是吸收透析袋中渗出小分子溶剂，吸水剂干燥后可继续反复使用，同时该步骤可简单、快速地更换酶的缓冲液，且对酶的生物活性无影响，具有成本低、操作方便、条件温和、能较好地保持酶的活性、回收率高等优点；