[发明专利]小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取以及活性测定有效
| 申请号： | 201710935082.2 | 申请日： | 2017-10-10 |
| 公开（公告）号： | CN107794250B | 公开（公告）日： | 2020-11-17 |
| 发明（设计）人： | 陈庆国;王亚超;李晶晶;刘梅;陶玲;国青青 | 申请（专利权）人： | 浙江海洋大学 |
| 主分类号： | C12N9/02 | 分类号： | C12N9/02;C12Q1/26 |
| 代理公司： | 北京国翰知识产权代理事务所(普通合伙) 11696 | 代理人： | 吕彩霞 |
| 地址： | 316000 浙江省*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 小球藻 邻苯二酚 双加氧酶 提取 以及 活性 测定 | ||
1.小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取，包括胞内酶粗酶液制备、浓缩透析、首次纯化、二次纯化，其特征在于：
胞内酶粗酶液制备：将对数期后期小球藻液抽滤，烘干得小球藻粉，然后在2-5℃下研磨5-15min，再加入pH为7.8-8.2的Tris-HCl缓冲液，小球藻粉与Tris-HCl缓冲液的重量体积比为1:1.8-2.3，混合均匀后在温度为2-5℃、转速为8000-12000r/min的条件下离心10-20min，上清液即为胞内酶粗酶液；
浓缩透析：将胞内酶粗酶液经0.15-0.3μm微孔滤膜过滤，再用聚乙二醇PEG20000浓缩，并用浓度为9-11mmol/L、pH为6.8-7.2的磷酸盐缓冲液透析12-18h，即得邻苯二酚1,2-双加氧酶的粗品；
首次纯化：先用浓度为13-17mmol/L、pH为7.0-7.5的磷酸缓冲液对DEAE纤维素柱平衡，然后将邻苯二酚1,2-双加氧酶粗品上样到纤维素柱上，用浓度为24-27mmol/L、pH为7.3-7.7的磷酸缓冲液洗脱，经聚乙二醇PEG20000浓缩后，再用浓度为9-11mmol/L、pH为6.8-7.2的磷酸缓冲液透析12-24h，最后用超滤膜再次浓缩即可；
二次纯化：用含有0.11-0.13mmol/L水合肼、浓度为4-6mmol/L、pH为7.3-7.7的磷酸缓冲液对Mono-Q柱平衡后，将首次纯化后的邻苯二酚1,2-双加氧酶粗品上样，用浓度为24-27mmol/L、pH为7.3-7.7的磷酸缓冲液洗脱，再用浓度为9-11mmol/L、pH为6.8-7.2的磷酸缓冲液透析12-24h，最后用超滤膜浓缩，干燥，即得邻苯二酚1,2-双加氧酶。
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