[发明专利]一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统

说明书

本发明提供了一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统，其特征在于，该系统包括在CRISPR/Cas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA，所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′‑G(21N)NNGRRT‑3或者5′‑ARRCNN(21N)C‑3′的序列排列规则，所述靶向敲除TCR基因的靶序列以病毒为转染载体，其中5′端和3′端带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因可以通过所述的病毒为载体，使用时与含有TCR基因的靶序列的病毒共同转染细胞，或把TCR基因的靶序列、Cas9、5′端和3′端都带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因，三者一起包装到杆状病毒中，以杆状病毒为载体转染细胞。

技术领域

本发明涉及基因靶向编辑领域，尤其涉及一种利用基因编辑技术制备可异体移植T细胞技术，具体的为一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统。

背景技术

近年来，利用免疫疗法来治疗肿瘤，受到广泛的关注。在众多的免疫疗法中，基于嵌合抗原受体T细胞(ChimericantigenreceptorTcells，CAR-T)疗法，效果最为显著和成熟。目前已经有多例临床试验证明，该技术可以治愈多种肿瘤，例如B细胞肿瘤。其基本原理是利用基因工程的方法，将能识特异识别肿瘤细胞的受体基因，利用整合型病毒作为载体，将该受体基因整合到患者T细胞基因组中，从而使改造后的T细胞具有特异性识别和杀伤肿瘤细胞的目的，从而达到治疗肿瘤的效果。另一方面，该技术还存在一些急需解决的障碍，首先，该技术只能针对病人自体T细胞进行编辑，大大提高了其治疗成本及延长治疗周期(利用病人自身T细胞制备CAR-T细胞，一般耗时长)；第二，由于T细胞表面不仅表达CAR还有自身的TCR受体表达，研究发现TCR受体会影响CAR受体的功能，有临床研究表面，可对神经系统造成伤害，形成脑水肿。

为解决以上CAR-T治疗技术的问题，多个研究小组利用基因编辑技术(ZFN，TALEN)针对TCR受体敲除，取得了显著效果。有研究报道，目前利用TALEN技术敲除TCR受体来制备MCAR-T技术(MniversalCAR-T)，该技术一方面将TCR受体通过TALEN定点敲除，另一方面通过同源重组技术将CAR基因定点整合到TCR基因位点。该技术不仅有效的避免了异体移植导致的移植物抗宿主反应GVHD(GhostVersμsHostDisease)，使得CAR-T细胞的制备摆脱个性化的缺陷而进入到标准化和规模化的时代，同时还避免了TCR基因对CAR受体功能的干扰。此外，由于CAR基因定点整合到TCR位点上，避免了现行CAR-T制备中CAR基因随机整合基因组所导致的潜在癌变风险。目前该技术已经获得了FDA的临床试验批文，而且利用该技术成功为两患者进行了治疗。然而由于ZFN或者TALEN技术属于第一，二代基因编辑技术，在应用方面存在很大的局限性，例如构建流程复杂、周期长、成本高等。

近几年基因编辑技术突破性的发展，利用现在的编辑手段，可以将目的基因进行精准编辑。尤其是第三代基因编辑技术CRISPR具有明显的优势，例如构建简单，效率高，成本低等。CRISPR系统均包含以下几个部分：1)PAM位点，位于靶序列的下游，只有几个nt(例如，SpCAS9/NGG；SaCAS9/NNGRRT)，根据此位点来选取靶序列；2)靶序列(sgRNA)，识别并与切割位点结合的序列，一般在20nt左右；3)TracRNA，连接于靶序列之后的一段回文RNA序列；4)Cas9内切酶，具有独立酶活性，Cas9含有在氨基末端的RμvC和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点，Cas9中的HNH活性位点剪切sgRNA的互补DNA链，RμvC活性位点剪切非互补链。其工作原理为：sgRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于sgRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-Ioop，使sgRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切sgRNA的互补DNA链，RμvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR技术目前已经广泛应用于多个领域，例如动植物育种，疾病治疗，以及基础科研等领域。