[发明专利]一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统

权利要求书

1.一种用于制备可异体移植T细胞的体外的基因编辑方法，其特征在于，该方法包括在CRISPR/Cas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA，所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′-G(21N)NNGRRT-3或者5′-ARRCNN(21N)C-3′的序列排列规则，所述靶向TCR基因的sgRNA以病毒为转染载体，所述方法还包括5′端和3′端带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因，使用时把靶向TCR基因的sgRNA、SaCas9基因、5′端和3′端都带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因，三者一起包装到病毒中，以病毒为载体转染细胞；

所述方法还包括以所述人TCR基因α链和β链恒定区作为靶标，筛选靶向TCR基因α链和β链的sgRNA，所述sgRNA在TCR基因上的靶序列满足的配对组合为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：17中的任意一组。

2.根据权利要求1所述的用于制备可异体移植T细胞的体外的基因编辑方法，其特征在于，所述靶向TCR基因的sgRNA以病毒为转染载体，所述病毒转染载体为腺相关病毒、慢病毒、腺病毒、杆状病毒、逆转录病毒中的一种。

3.根据权利要求1所述的用于制备可异体移植T细胞的体外的基因编辑方法，其特征在于，所述TCR基因包含α链和β链，基因改造具体方法为在TCR的α链和β链的一种或两种的CDS序列或恒定区域的相应编码基因的外显子区，利用CRISPR/Cas9进行定点切割，从而使TCR基因失活，达到T细胞表面无TCR受体的目的，编辑后的T细胞在有异体移植过程中避免移植物抗宿主反应。

4.根据权利要求1所述的用于制备可异体移植T细胞的体外的基因编辑方法，其特征在于，所述靶向TCR基因α链和β链的sgRNA筛选包括如下步骤：

步骤1)构建sgRNA的寡核苷酸双链：

S1：根据选择的sgRNA，通过化学合成法合成寡核苷酸链，格式如下：

正义链：5′-G(21N)NNGRRT-3′或者5′-ARRCNN(21N)C-3′，引物不含PAM，

反义链：与正义链互补，分别在正义链引物的5′端加上CACC，在反义链引物5′端加上AAAC，以形成BbsI酶切位点的粘性末端；其中，21N代表靶序列的21个碱基序列；

S2：把正义链引物和反义链引物经过退火，形成带有BbsI酶切位点的粘性末端的双链核苷酸小片段；

步骤2)CRISPR-Cas9载体构建；

步骤3)细胞系转染；

步骤4)突变效率检测。

5.一种基于权利要求1-4中任一项所述的用于制备可异体移植T细胞的体外的基因编辑方法的应用，其特征在于，用外周血或脐带血来源的T细胞，通过权利要求1-4中任一项所述的用于制备可异体移植T细胞的体外的基因编辑方法，制备成一种可异体移植的T细胞。