[发明专利]一种固定化酶催化合成NADPH的方法

说明书

本发明公开了一种固定化酶催化合成NADPH的方法，包括以下步骤：(1)在二价金属离子存在下，以NAD和偏磷酸盐为底物配制成第一反应液，向第一反应液中加入固定化NAD激酶，催化合成NADP；(2)去除第一反应液中的固定化NAD激酶，继续加入葡萄糖配制成第二反应液，向第二反应液中加入固定化葡萄糖脱氢酶，催化合成NADPH。上述方法实现了以连续反应合成NADPH，生产工艺简单，生产周期短，生产成本低，产品质量更加稳定；另一方面，采用固定化酶催化制备NADPH，固定化酶能够连续、反复多次使用，进一步降低了生产成本，避免了产物中引入蛋白杂质，固定化酶应用于上述方法中有利于生产高纯度和高收率的NADPH。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种固定化酶催化合成NADPH的方法。

背景技术

还原型辅酶II(triphosphopyridine nucleotide，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，简称：NADPH)是一种极为重要的核苷酸类辅酶，它是氧化型辅酶I(NicotinamideAdenine Dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称：NAD)中与腺嘌呤相连的核糖环系2’-位的磷酸化衍生物。NADPH作为细胞内最为重要的电子供体和生物合成的还原剂，可为还原性生物合成提供氢离子，参与如氨基酸、脂肪酸、胆固醇、单加氧酶系、类固醇激素等生物分子的合成。NADPH除了参与生物合成，还参与体内羟化反应和药物、毒物及某些激素的生物转化。例如，NADPH可利用解毒细胞的电子供体，通过体内代谢减少生物体氧化型化合物，维持其氧化还原的平衡，在氧化防御系统发挥重要作用。NADPH也可以借助于异柠檬酸穿梭作用进入呼吸链产生ATP:由于线粒体内膜对物质的通透性很低，线粒体外产生的NADPH不能直接进入呼吸链被氧化。NADPH上的Η可以在异柠檬酸脱氢酶的作用下被交给NAD+，然后由NAD+进入呼吸链产生能量。NADPH还是谷胱甘肽(GSH)的还原酶的辅酶，可使氧化型谷胱甘肽(GSSG)生成还原型GSH，维持还原型的GSH的正常含量。GSH是细胞内重要的抗氧化剂，可保护一些含巯基的蛋白质、脂肪和蛋白酶类免受氧化剂的破坏，特别在维持红细胞膜的完整性方面起着重要作用。目前，基于NADPH的多重生理功能，已有文献报道NADPH作为制备防治脑缺血性中风、心脏疾病，以及抗疲劳药物的应用。随着NADPH在医药行业及保健品行业越来越广泛的应用，对生产NADPH方法的研究具有重大的理论意义和经济意义。

NADPH是NADP+的还原形式，目前NADP+的合成方法可以分为化学法和生物法，化学法以烟酰胺为原料，经多步反应合成出NADP+，化学法存在反应路线长，反应条件苛刻，选择性差，易生成副产物，产物纯度低，收率低，需用到昂贵的试剂，成本较高等不足；此外，大量有机溶剂的使用还会造成环境污染。因此，该工艺路线不适合于工业化大生产(JamesDowden et al,Chemical Synthesis of the Second Messenger Nicotinic AcidAdenine Dinucleotide Phosphate by Total Synthesis of Nicotinamide AdenineDinucleotide Phosphate,Angew.Chem.Int.Ed.2004,43:4637-4640)。传统的生物法是采用发酵或其它微生物培养技术,并通过对酵母或其它微生物的分离提取得到NADP+。该工艺过程虽然已很成熟，但是原料耗费巨大，劳动强度大，能源消耗大，产量有限，生产成本高，产品价格高，限制了氧化型辅酶II(NADP+)的广泛应用(Sakai.T,Biotech.Bioeng.1980,22,Suppl.1,143-162；Uchida，T.etal,Agric.Biol.Chem.1971,37,1049-1056；Sakai,T.and Uchida，T.et al,Agric.Biol.Chem.1973,37,1041-1048)。