[发明专利]一种固定化酶催化合成NADPH的方法

权利要求书

1.一种固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在二价金属离子存在下，以NAD和偏磷酸盐为底物配制成第一反应液，向所述第一反应液中加入固定化NAD激酶，催化合成NADP；

（2）滤除所述第一反应液中的固定化NAD激酶，加入葡萄糖配制成第二反应液，向所述第二反应液中加入固定化葡萄糖脱氢酶，催化合成NADPH。

2.根据权利要求1所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述二价金属离子为镁离子，所述NAD、所述偏磷酸盐和所述镁离子以1：（1~20）：（0.025~2.5）的质量比混和于溶剂中，所述溶剂与所述NAD的质量比为（10~100）：1，形成所述第一反应液。

3.根据权利要求1或2所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述固定化NAD激酶与所述NAD的质量比为（1~20）：1。

4.根据权利要求1或2所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述NADP合成的反应条件为：调节pH为4~8，在25℃~55℃的温度下反应10~40小时。

5.根据权利要求1所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，按照所述葡萄糖与所述NAD的摩尔比为（0.1~5）：1加入所述葡萄糖后，补充加入溶剂，至所述溶剂与所述NAD的质量比为（10~100）：1，形成所述第二反应液。

6.根据权利要求1或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述固定化葡萄糖脱氢酶与所述NAD的质量比为（0.1~5）：1。

7.根据权利要求1或2或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述NADPH合成的反应条件为：调节pH为6~9，在5℃~35℃的温度下反应至pH保持稳定。

8.根据权利要求2或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述溶剂为纯化水或包括磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和磷酸二氢钠中至少一种的水溶液。

9.根据权利要求1或2或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，还包括将所述NAD激酶和葡萄糖脱氢酶固定化的方法：

a. 将酶载体用质量浓度为1-3%的戊二醛活化后过滤，作为固定化载体；

b. 分别将固定化载体加入NAD激酶和葡萄糖脱氢酶的酶液中，调节pH为5~9，在10℃~30℃下缓慢搅动，固定18~36小时得到固定化NAD激酶和固定化葡萄糖脱氢酶。

10.根据权利要求9所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述NAD激酶与所述酶载体的质量为比1:5，所述葡萄糖脱氢酶与所述酶载体的质量为比1:5。

11.根据权利要求9所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，固定所述NAD激酶的酶载体为LX-1000HFA，固定所述葡萄糖脱氢酶的酶载体为LX-1000NH。

12.根据权利要求9所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，还包括NAD激酶和葡萄糖脱氢酶的制备方法：

1）分别发酵培养所述NAD激酶的生产菌和所述葡萄糖脱氢酶的生产菌，发酵结束后收集菌体，将收集的菌体破碎后得到NAD激酶的粗酶液和葡萄糖脱氢酶的粗酶液；

2）将步骤1）中得到的粗酶液进行絮凝，然后过滤所述粗酶液，得到纯化的NAD激酶的酶液和葡萄糖脱氢酶的酶液。

13. 根据权利要求12所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述NAD激酶的生产菌为克隆有SEQ ID NO.1所示基因的大肠杆菌基因工程菌，所述葡萄糖脱氢酶的生产菌为克隆有SEQ ID NO.2所示基因的大肠杆菌基因工程菌。