[发明专利]一种生物酶催化制备氨基硝基酚的方法

说明书

技术领域

本发明属于化工技术领域，特别涉及到使用豆荚过氧化物酶催化制备精细化工中间体2-氨基-5-氯-4-氟酚-3-硝基酚的技术。

背景技术

2-氨基-5-氯-4-氟酚-3-硝基酚是一种重要的精细化工中间体，用传统的化学工艺生产该产品，将产生大量的废酸和含有有机物的酸性废水而导致环境污染严重，而且所得产物几乎没有选择性而产生原材料的浪费。现有工艺无法避免强酸所造成设备的腐烛及反应过程中发生多氧化等副产物对反应带来的安全隐患等问题。该类化合物产品生产的资源消耗要远远高于大吨位基础化工产品，各类环境污染安全生产事故更是频繁发生 这一现状严重制约了整个产业的可持续发展。做到绿色环保、清洁生产对于企业来说不再是锦上添花，而是关乎生死的一件大事。

因此该类产品生产工艺的研究，特别是开发新的生产路线的研究，一直相当活跃，主要围绕着提高产物的选择性和改善反应的环境，减少反应所引起的环境污染。

生物酶催化反应具有环境友好、选择性好的特点，目前尚未见用生物酶催化合成该产品的报道。如果能将生物酶用于催化生产该产品，则可能大幅度提高产物的选择性，消除传统反应所引起的环境污染，实现绿色生产该产品。

过氧化物酶是氧化还原酶类一种，是一个大家族，包括辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶、髓过化氧物酶、微生物过氧化物酶(如氯过氧化物酶)、大豆过氧化物酶等等，被用于催化许多化学反应，可催化H₂O₂与多种有机、无机氢供体发生氧化还原反应，例如脱甲基反应、环氧化反应、聚合反应、偶联反应等。

大豆过氧化物酶，一般是指豆壳过氧化物酶，即由大豆种皮提取的过氧化物酶。实际上，大豆豆荚也含有过氧化物酶，从大豆荚提取的过氧化物酶称之为大豆荚过氧化物酶，或简称为豆荚过氧化物酶。由于豆荚的量多于豆皮，所以，豆荚过氧化物酶的量更大。我们的实验表明，豆壳过氧化物酶与豆荚过氧化物酶在催化反应中，也存在较大的差别。

发明内容

在H₂O,，NaNO₂存在下，采用豆荚过氧化物酶催化底物（1），即2-氨基-5-氯-4-氟酚,反应生成（2），即2-氨基-5-氯-4-氟酚-3-硝基酚，具体反应式如下：

考虑到多种过氧化物酶都可能催化底物，得到我们的目标产物，所以，我们用多种过氧化物酶进行了催化反应实验，以选择最佳的过氧化物酶，所用的酶包括辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶、氯过氧化物酶(来自海洋真菌 Caldariomyces fumago)、大豆壳过氧化物酶、豆荚过氧化物酶等。其中辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶、氯过氧化物酶(来自海洋真菌 Caldariomyces fumago)、大豆壳过氧化物均可由市场购得，而豆荚过氧化物酶市场没有商品出售，由我们自己从大豆荚提取。

从大豆荚提取豆荚过氧化物酶的分离纯化工艺如下。

经过大量实验研究，得到优化的豆荚过氧化物酶分离纯化新工艺。新鲜大豆荚10kg用粉碎机粉碎后，粒度小于1mm，加50L去离子水室温下浸泡4小时，浸泡液过滤后，得到初提液，初提液体积V；搅拌中对初提液加入固体硫酸铵，使成45%饱和度，此时体积为V1；继续搅拌中再加入0.3V的预冷丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液1，对上清液1加固体硫酸铵，按V1体积计算到75%饱和度，经5000rpm，10分钟离心；此时，在水相与丙酮相界面处将形成一层沉淀，即沉淀1，取沉淀1，加入沉淀1体积5倍的去离子水溶解沉淀1，超滤脱盐后，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液2，上清液2体积V2，取上清液2，用丙酮分级沉淀：对上清液2先加1.0V2体积丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液3，对上清液3再加0.8V2体积丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到沉淀2。减压抽干沉淀2中的丙酮，加10倍沉淀2体积的去离子水溶解沉淀2，调pH到8.0，加1mol/L硫酸锌，使硫酸锌成0.01mol/L终浓度，经5000rpm，10分钟离心，离心后得上清液4；将上清液4调pH至7，用超滤脱盐浓缩，冷冻干燥，得到豆荚过氧化物酶粉，酶活为30-40U/mg。

用干豆荚也可提取豆荚过氧化物酶，方法如下。干大豆荚10Kg，加120L去离子水浸泡1小时，用粉碎机粉碎后，4℃浸泡过夜，浸泡液过滤后，得到初提液体积V。其余步骤同鲜豆荚，不再赘述。

使用分光光度法测定豆荚过氧化物酶的酶活性。