[发明专利]一种生物酶催化制备氨基硝基酚的方法

权利要求书

1.一种生物酶催化制备氨基硝基酚的方法，其特征在于用豆荚过氧化物酶催化制备2-氨基-5-氯-4-氟酚-3-硝基酚，底物为2-氨基-5-氯-4-氟酚，生产的目标产物为2-氨基-5-氯-4-氟酚-3-硝基酚，反应介质为水-异丁醇，其中水相为pH7.1的磷酸盐缓冲液，水相：异丁醇=76:24，将底物溶入异丁醇，然后加入反应器，反应温度50.5-52.5℃，反应时间为9.6-10.8h，豆荚过氧化物酶浓度为4-5mU/ml，底物浓度为30mM，NaNO₂浓度为350mM，H₂O₂采用流加的加料方式，反应开始时，加入H₂O₂，使其浓度为8.5mM，启动酶催化反应；然后开始流加，用蠕动泵加入H₂O₂，使浓度维持在7.5-9.5mM；反应结束后，得到目标产物，用环己烷萃取3次，合并有机相，减压蒸出有机溶剂，得到产物；底物转化率为95.6-97.5%，目标产物产率为81.4-82.3%。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述豆荚过氧化物酶的提取方法为：

新鲜大豆荚用粉碎机粉碎后，粒度小于1mm，加5倍大豆荚质量的去离子水室温下浸泡4小时，过滤浸泡液，得到初提液，初提液体积V；搅拌中对初提液加入固体硫酸铵，使成45%饱和度，此时体积为V1；继续搅拌中再加入0.3V的预冷丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液1，对上清液1加入固体硫酸铵，按V1体积计算加到75%饱和度，经5000rpm，10分钟离心；此时，在水相与丙酮相界面处将形成一层沉淀，即沉淀1，取沉淀1，加入沉淀1体积5倍的去离子水溶解沉淀1，超滤脱盐后，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液2，上清液2体积V2，取上清液2，用丙酮分级沉淀：对上清液2先加1.0V2体积预冷丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液3，对上清液3再加0.8V2体积丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到沉淀2；减压抽干沉淀2中的丙酮，加10倍沉淀2体积的去离子水溶解沉淀2，调pH到8.0，加1mol/L硫酸锌，使硫酸锌成0.01mol/L终浓度，经5000rpm，10分钟离心，得上清液4；将上清液4调pH至7，用超滤脱盐浓缩，冷冻干燥，得到豆荚过氧化物酶粉，酶活为30-40U/mg；

用干豆荚也可提取豆荚过氧化物酶，方法如下：干大豆荚，加12倍干大豆荚质量的去离子水浸泡1小时，用粉碎机粉碎后，4℃浸泡过夜，将浸泡液过滤后，得到初提液，初提液体积V；其余步骤同鲜豆荚。