[发明专利]水稻抗褐飞虱基因BPH9基因内特异SNP共显性分子标记引物及应用

说明书

本发明公开了一种水稻抗褐飞虱基因BPH9内特异SNP共显性分子标记引物，属于植物分子育种领域。本标记引物及其序列分别为：BPH9‑IF:ACCATTGTTAGGCAGTTGTTCA；BPH9‑ER:ATTCGACTCCCTTTCTTGTTATCT；BPH9‑IR:CAGCCTCCTGAAGAGATCTTTCA；BPH9‑EF:AATGTCGCACCCAGCAGC。本发明利用该引物对水稻DNA样本进行PCR扩增，可快速判断待测水稻BPH9的基因型，方法简便快捷、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源BPH9基因型的鉴定。

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及水稻抗稻飞虱基因BPH9 基因内特异SNP共显性分子标记引物与应用，本发明提供的分子标记引物适于在水稻育种中对BPH9基因型的大量筛选以及从水稻种质资源中筛选新的BPH9基因型抗性亲本。

背景技术

随着生物技术的发展，人类进入后基因组时代，全面开展功能基因组研究已成为生命科学研究的前沿领域。目前，水稻基因组精细遗传图谱和物理图谱已经完成，进一步对水稻功能基因进行研究，对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。

水稻是我国重要的粮食作物，褐飞虱是我国稻区最为严重的虫害之一，严重影响稻谷的产量和质量。利用抗虫基因培育抗虫水稻品种是控制水稻褐飞虱最为经济有效的方式。由于水稻抗褐飞虱抗性鉴定复杂，利用常规手段选育抗虫品种往往需要较大的投入、以及难以有效的导入和聚合不同的抗虫基因。因此，利用分子标记辅助选择、聚合具有不同抗谱的抗虫基因，培育广谱、持久抗虫品种是解决水稻褐飞虱虫害的最佳途径。

水稻抗褐飞虱基因BPH9位于水稻12号染色体，其供体亲本来源Pokkali，是一个对褐飞虱多个生物型具有广谱抗性的品种，因此通过开发BPH9特异性分子标记，利用分子标记辅助选择将BPH9抗性等位基因导入栽培稻品种，对培育具有褐飞虱抗性的水稻品种具有重要意义。目前分子标记辅助选择育种中，对BPH9基因的选择主要利用与之连锁的标记，如RM28483、InD28450、InD28453、InD284323、 InD2、InD14、RM28466、RM28481、RM2848等，而基因标记还未见报道，这在一定程度上影响了BPH9在水稻抗褐飞虱育种中选择的效率和准确性。

两对交叉引物PCR(PCR with confronting two-pair primers， PCR-CTPP)是一种操作简便、分型快速、费用低廉的SNP分型方法，该方法通过一次PCR反应和常规电泳技术即可区分3种不同基因型，其基本原理为：引物3’存在错配时，延伸效率会降低，扩增受阻。基于此原理，以SNP位点分别为正反引物的3’设计两条特异性引物，并分别在SNP位点的上下游设计两条外引物，根据两对引物的扩增片段大小和数量鉴定SNP的类型。

本发明在PCR-CTPP方法基础上加以改进，BPH9基因的第一个外显子的第725和726碱基处存在两个连续的SNP位点，其中BPH9 抗性基因为5’-CA-3’，其余等位基因为5’-TG-3’，以该两个SNP位点分别为正反两条特异性内引物3’的第一和第二位碱基进行引物设计，并在3’端第3位碱基引入错配，增加引物的特异性开发一套利用 PCR电泳便可区分BPH9基因3种不同基因型的特异性分子标记，通过设计4条引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增带型判断BPH9基因型。具有纯合抗性BPH9等位基因的材料扩增出 230bp特异性条带；具有其他纯合BPH9等位基因的材料扩增出316bp 特异性条带；杂合等位基因扩增出230bp、316bp条带，3种基因型均可扩增出503bp的非特异性条带。因此，利用一次PCR扩增就可将3种不同基因型材料区分，该方法简单可控、成本低廉，适于田间大量材料的基因型鉴定，提高育种效率。

发明内容