[发明专利]一种多波段荧光损耗方法、多色超分辨成像方法及装置

说明书

本发明公开了一种多波段荧光损耗方法、多色超分辨成像方法及装置。多波段荧光指在NaGdF₄:Yb³⁺/Tm³⁺核心外包裹掺杂其他活化离子的壳层，通过Yb³⁺/Tm³⁺敏化、上转换过程，电子到达Tm³⁺高能级，再依次迁移能量到Gd³⁺离子、壳层活化离子X³⁺发出上转换荧光。改变活化离子，借助同样的敏化、上转换、能量迁移过程，发出的上转换荧光不同。荧光损耗过程利用810nm附近波长激光在Tm³⁺匹配能级之间引起受激辐射，使上转换过程中中间能级电子受激辐射跃迁至低能级，从而损耗Tm³⁺高能级的电子数，损耗由Tm³⁺高能级经由Gd³⁺传递到X³⁺发射的多波段荧光。基于该荧光损耗方法，合成不同活化离子的纳米颗粒，用同一对激发光和空心损耗光，实现多色超分辨显微成像。可极大简化光路系统，降低系统成本。

技术领域

本发明属于光学显微技术领域，具体涉及一种实现单对近红外波长激光激励的多波段荧光损耗方法，以及利用上述损耗方法实现的基于单对激光的多色超分辨成像方法及成像装置。

背景技术

在常规的光学成像过程中，根据阿贝原则，光学系统所能够达到的极限分辨率大小约为入射光波长的一半。为了提高分辨率，科学家们提出了许多种突破衍射极限的方法，统称为超分辨成像方法。其中一种重要方法就是受激辐射损耗术(Stimulated EmissionDepletion,STED)。STED显微术需使用激发光束以及经过相位调制后得到的空心光束。STED中，利用受激辐射的方法，用损耗激光对激发光斑外围的荧光发光强行淬灭回基态，从而达到损耗荧光发光，提高分辨率的目的。相比较其他的超分辨成像方法，STED不仅可以达到纳米级的分辨率，并且能够实现视频速度的快速成像，因此成为了生物学研究中一种重要的方法。不仅如此，结合双光子激励(Two-Photon Excited,TPE)方法，TPE-STED方法将激发波长从紫外、可见波段转移到近红外波段，极大地降低了激光对生物组织损伤的同时，也显著地提高了成像深度。

但目前来说，利用传统染料的TPE-STED技术在深度组织超分辨成像中仍然面临一定的限制和挑战，主要体现在：(1)损耗激光仍然位于可见光波段，在生物组织中散射严重，在较大的深度中很难达到理想的损耗效果。(2)损耗光功率较大，会对生物组织造成严重的热损伤。(3)常用的STED荧光发光染料普遍存在光漂白或者光闪烁的问题，达不到足够的光稳定性，不能满足长时间成像的需要。(4)TPE-STED成像所使用的光源为高功率飞秒光源，价格昂贵且光学系统复杂，难以推广。

为了克服以上困难，申请人已在先开发了使用连续近红外激光激发、损耗的，基于稀土掺杂上转换纳米颗粒的STED显微技术，但目前该技术只实现了单一种纳米颗粒的超分辨成像，应用到成像中得到信息量有限。因此，开发更多具备不同上转换发光并能够高效损耗的材料，通过多通道探测，实现多色超分辨成像意义重大。

发明内容

本发明的一个目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种多波段荧光损耗方法，该方法基于同一对近红外波长激光激发/损耗，突破传统受激辐射发光损耗的局限，使用稀土掺杂上转换纳米材料作为发光染料，通过对上转换过程中多个能级进行受激辐射激励，对多波段荧光同时实现高效率光控损耗。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述多波段荧光损耗方法实现多色超分辨成像的方法，该方法可实现不同纳米颗粒标记的多色超分辨成像。

本发明的另一目的在于提供一种用于实现上述多色超分辨成像方法的成像装置。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种多波段荧光损耗方法，包括以下步骤：