[发明专利]一种多波段荧光损耗方法、多色超分辨成像方法及装置

权利要求书

1.一种多波段荧光损耗方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)通过稀土掺杂合成不同的核壳结构上转换纳米颗粒，利用同一近红外激发光激发不同核壳结构上转换纳米颗粒产生不同的多光子荧光，激发光的波长为975nm；所述核壳结构上转换纳米颗粒，其核是敏化离子、积累离子和迁移离子共同掺杂的纳米晶体，具体地其核以NaGdF₄为基质，其中的Gd³⁺作为迁移离子，并掺杂有Yb³⁺作为敏化离子和Tm³⁺作为积累离子；壳层是迁移离子、活化离子共同掺杂的纳米晶体，不同的上转换纳米颗粒包括的活化离子不同，具体地壳层同以NaGdF₄为基质，其中的Gd³⁺作为迁移离子；敏化离子被用作吸收激发光泵浦光子，随后促进临近的积累离子到达激发态，迁移离子将积累离子高能级的电子传递给活化离子，不同的活化离子发出不同上转换荧光；(2)增加一束近红外损耗激光进行损耗，这束近红外损耗激光的波长与积累离子中相对应的两个能级的能量间隙匹配，通过引起受激辐射损耗过程，阻断了特定能级的进一步上转换过程，从而实现单对激光的作用下，同时损耗来自积累离子、迁移离子和活化离子的多波段的上转换发光；具体地，所述近红外损耗激光波长位于810nm附近，能够损耗积累离子Tm³⁺辐射的455nm波段蓝光，以及高能级的电子，进而能够损耗由积累离子高能级电子传递能量到活化离子所辐射的荧光。

2.根据权利要求1所述的多波段荧光损耗方法，其特征在于，步骤(1)中所述近红外激发光为能够有效激发Yb³⁺的波长。

3.根据权利要求1所述的多波段荧光损耗方法，其特征在于，所述的活化离子是Tb³⁺、Eu³⁺、Mn²⁺、Sm³⁺、Dy³⁺、Nd³⁺稀土离子中的一种或两种以上组合，它们有不同的荧光辐射能级。

4.根据权利要求1所述的多波段荧光损耗方法，其特征在于，所述核壳结构上转换纳米颗粒，在核与壳层之间加了一层NaGdF₄作为隔离层。

5.一种基于权利要求1-4任一项所述多波段荧光损耗方法的多色超分辨成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

光路分为两条光路，在第一条光路中，第一近红外光纤耦合激光器发出一束稳定的975nm波长单模激光，该激光准直后，作为高斯型实心光束，从而获得高斯型实心光斑；

同时在另一条光路中，第二近红外光纤耦合激光器产生稳定的810nm波长单模激光，该激光准直后，经过空间相位调制板调制形成中心光强为0的空心光束，从而获得损耗光斑；第二近红外光纤耦合激光器产生的近红外波长激光的波长能量与积累离子中相对应的两个能级的能量间隙相匹配；

所述高斯型实心光斑与所述损耗光斑空间上进行共轴耦合，高斯型实心光斑激发稀土掺杂合成的上转换纳米颗粒产生上转换发光，损耗光斑通过引起受激辐射损耗过程，使积累离子中涉及上转换过程的特定能级能量被消耗，从而阻断进一步的上转换和能量传递过程，实现对产生的上转换发光的损耗；

将掺杂不同活化离子的上转换纳米颗粒，通过生物化学方法，标记在样品的不同部位或结构上，用同一近红外激发光和近红外损耗激光经物镜聚焦后作用到样品上，并进行XYZ方向扫描，通过二色镜和滤光片分离不同纳米颗粒发出的不同波长的上转换荧光信号，利用多个光电探测器同步对不同波长信号进行探测，从而得到不同纳米颗粒的分布图像，将不同纳米颗粒分布图像染色后叠加，即实现多色超分辨显微成像。