[发明专利]CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除的caco‑2细胞模型及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除的caco-2细胞模型及其方法。

背景技术

药物转运研究是新药研发过程的重要内容。转运体，通过转运体进行继发性主动转运，即依靠存在于细胞外高浓度钠离子的势能(该势能由原发性主动转运提供)转运，即相当于间接消耗ATP的能量。例如小肠粘膜上皮细胞主动吸收葡萄糖的过程中，转运能量并不直接来自于ATP的分解，而是依靠上皮细胞(低)与肠腔液(高)之间的钠离子浓度梯度，在钠离子顺浓度梯度进入上皮细胞的同时，葡萄糖逆浓度梯度一同被转运进细胞。ATP结合转运体家族主要成员P-gp、BCRP及MRP2参与大量化合物转运，是目前常用候选转运体。然而三者底物及抑制剂的交叉反应严重影响结果分析。

CRISPR-Cas9具有更快速、简便、高效、多位点、特异性靶向敲除基因的优势。CRISPR-Cas9的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(singleguide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9 nuclease-null)融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。也为解决上述问题提供了一种可能的选择。

发明内容

本发明的目的在于提供CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除caco-2细胞模型及其方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案。

CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除caco-2细胞模型的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：

1)对P-gp、BCRP及MRP2转运体设计靶点特异性的sgRNA，设计的sgRNA序列如序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所示，构建sgRNA表达载体；

2)利用CRISPR/CAS9分别设计P-gp、BCRP及MRP基因单敲除及两两组合双敲除，与hCas9质粒共转染caco-2细胞，进行单克隆化扩大培养，即得转运体基因靶向性的caco-2细胞模型。

优选的，步骤1)中，以U6启动子表达sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体。

本发明还提供由以上方法得到的caco-2细胞模型。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过CRISPR/CAS9结合细胞单克隆技术，对ABC家族P-gp、BCRP及MRP进行了系列单敲除或双敲除，获得一系列基因敲除的caco-2细胞模型。该caco-2细胞模型将有效排除不同转运体之间相互干扰，为药物转运研究提供更特异、更灵敏的细胞模型。

附图说明

图1是靶位点PCR产物T7EI酶切后电泳结果图；

图2a是caco-2细胞单克隆(2A10)的示意图；

图2b是caco-2细胞单克隆(B14)的示意图；

图2c是caco-2细胞单克隆(2M1)的示意图；

图3是2A10单克隆敲除纯合子鉴定结果图；

图4是B14单克隆敲除纯合子鉴定结果图；

图5是2M1单克隆为2种基因型的敲除纯合子鉴定结果图；

图6是AM17单克隆的MRP2位点2种基因型的敲除纯合子鉴定结果图；

图7是AB16单克隆的BCRP位点敲除纯合子鉴定结果图；

图8是MB11单克隆的BCRP位点2种基因型敲除纯合子鉴定结果图；

图9a、图9b是单克隆细胞P-gp和MRP2转运体蛋白表达检测结果图；

图10是AB5和2A10单克隆的P-gp转运功能分析结果图。

具体实施方式