[发明专利]一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法及其培养基组

说明书

本发明公开了一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法，包括以下步骤：1)从离体皮肤组织中分离表皮干细胞，在表皮干细胞培养基进行传代培养；2)将步骤1)得到的表皮干细胞进行传代培养、加入汗腺细胞诱导培养基进行诱导分化；和3)利用汗腺细胞培养基进行传代与增殖。本发明同时提供了相对应的培养基组。该方法细胞源有效地避免了伦理学争议，该制备方法有助于制得细胞定向分化、增殖情况较均一的汗腺细胞。

技术领域

本发明涉及一种生物组织培养技术领域，尤其涉及一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法及其培养基组。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，具有保护身体，排汗，感觉冷热和压力等功能。汗腺分泌汗液，散发体热。大面积的烧伤病人，创面修复后，汗腺缺失，导致体温调节功能受影响。人工皮肤修复创面，仅具有表皮、真皮层结构，无汗腺及其他皮肤附属器。组织工程化皮肤难以构建汗腺，是目前有待解决的难题。模拟汗腺的发生机制来诱导干细胞向汗腺细胞定向分化，可能是重建汗腺的唯一途径。以表皮干细胞来诱导分化汗腺细胞，而达到汗腺细胞扩增培养的目的，具有较好的应用前景，但表皮干细胞的细胞分化、代谢的机制尚不清晰，定向分化需要克服较多不确定因素。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种稳定的、定向分化的由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法。

本发明的目的之二在于提供上述由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的培养基组。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法，包括以下步骤：

1)从离体皮肤组织中分离表皮干细胞，在表皮干细胞培养基进行传代培养；

所述表皮干细胞培养基为含有氢化可的松、胰岛素、腺嘌呤、青霉素、人表皮生长因子、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基壳聚糖的DMEM培养基；

2)将步骤1)得到的表皮干细胞进行传代培养，待其融合度达到80％时，弃去培养基，用DMEM/F12清洗，加入汗腺细胞诱导培养基进行诱导分化；

所述汗腺细胞诱导培养为含有人表皮生长因子、霍乱毒素、三碘甲状腺原氨酸和氯化乙酰胆碱的DMEM培养基；

3)培养若干天后，待培养基内出现多边形、铺路石样的细胞，即为汗腺细胞，将培养基换成汗腺细胞培养基，培养若干天后，进行传代与增殖；

所述汗腺细胞培养基为含有EGF、牛垂体提取物、青霉素和链霉素的DMEM 培养基。

进一步地，步骤1)中，所述离体皮肤组织为健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮。

进一步地，步骤1)中，从离体皮肤组织中分离表皮干细胞具体操作为：取 3-6岁健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮，无菌条件下，氯霉素清洗皮肤组织，加分散酶于4℃作用18-24h，分离表皮组织；无菌PBS清洗表皮组织，0.25％胰酶-EDTA消化4h，加入表皮干细胞培养基终止，1000r/min，离心5min，收集表皮细胞，无菌PBS清洗三遍，加入表皮干细胞培养基重悬，置于Matrigel包被的培养板进行培养，得到表皮干细胞。

进一步地，步骤2)中，诱导分化时，每天更换汗腺细胞诱导培养基。

进一步地，所述表皮干细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的 DMEM培养基：0.1-2ng/mL氢化可的松、0.01-1ng/mL胰岛素、1-5×10-4mol/L 腺嘌呤、50-200IU/mL青霉素、5-50ng/mL人表皮生长因子、2-50μg/mL转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-20μM Y-27632和0.01-1mg/mL羧甲基壳聚糖。