[发明专利]一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法及其培养基组

权利要求书

1.一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法，包括以下步骤：

1)从离体皮肤组织中分离表皮干细胞，在表皮干细胞培养基进行传代培养；

所述表皮干细胞培养基为含有氢化可的松、胰岛素、腺嘌呤、青霉素、人表皮生长因子、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基壳聚糖的DMEM培养基；

2)将步骤1)得到的表皮干细胞进行传代培养，待其融合度达到80％时，弃去培养基，用DMEM/F12清洗，加入汗腺细胞诱导培养基进行诱导分化；

所述汗腺细胞诱导培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：25-100ng/mL人表皮生长因子、0.1-2×10^-10mol/L霍乱毒素、0.5-5×10^-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、2-8×10^-5mol/L氯化乙酰胆碱；

3)培养若干天后，待培养基内出现多边形、铺路石样的细胞，即为汗腺细胞，将培养基换成汗腺细胞培养基，培养若干天后，进行传代与增殖；

所述汗腺细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：10-100ng/mLEGF、10-50mg/mL牛垂体提取物、50-200U/mL青霉素和50-200μg/mL链霉素。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述离体皮肤组织为健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，从离体皮肤组织中分离表皮干细胞具体操作为：取3-6岁健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮，无菌条件下，氯霉素清洗皮肤组织，加分散酶于4℃作用18-24h，分离表皮组织；无菌PBS清洗表皮组织，0.25％胰酶-EDTA消化4h，加入表皮干细胞培养基终止，以1000r/min速度离心5min，收集表皮细胞，无菌PBS清洗三遍，加入表皮干细胞培养基重悬，置于Matrigel包被的培养板进行培养，得到表皮干细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，诱导分化时，每天更换汗腺细胞诱导培养基。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述表皮干细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：0.1-2ng/mL氢化可的松、0.01-1ng/mL胰岛素、1-5×10^-4mol/L腺嘌呤、50-200IU/mL青霉素、5-50ng/mL人表皮生长因子、2-50μg/mL转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-20μM Y-27632和0.01-1mg/mL羧甲基壳聚糖。

6.一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的培养基组，包括以下培养基：

表皮干细胞培养基：含有氢化可的松、胰岛素、腺嘌呤、青霉素、人表皮生长因子、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基壳聚糖的DMEM培养基；

汗腺细胞诱导培养：含有人表皮生长因子、霍乱毒素、三碘甲状腺原氨酸和氯化乙酰胆碱的DMEM培养基；

汗腺细胞培养基：含有EGF、牛垂体提取物、青霉素和链霉素的DMEM培养基。

7.如权利要求6所述的培养基组，其特征在于，

所述表皮干细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：0.1-2ng/mL氢化可的松、0.01-1ng/mL胰岛素、1-5×10^-4mol/L腺嘌呤、50-200IU/mL青霉素、5-50ng/mL人表皮生长因子、2-50μg/mL转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-20μM Y-27632和0.01-1mg/mL羧甲基壳聚糖。

8.如权利要求6所述的培养基组，其特征在于，

所述汗腺细胞诱导培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：25-100ng/mL人表皮生长因子、0.1-2×10^-10mol/L霍乱毒素、0.5-5×10^-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、2-8×10^-5mol/L氯化乙酰胆碱；

所述汗腺细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：10-100ng/mLEGF、10-50mg/mL牛垂体提取物、50-200U/mL青霉素和50-200μg/mL链霉素。